[发明专利]建立可控突变率突变库的方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及建立可控突变率突变库的方法与应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)[Bravo.A.，Gill S.S.，Soberón M.Bacillus thuringiensis Mechanisms and Use.Comprehensive Molecular lnsect Science Elsevier，2005，175～206.]，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。从1981年，Schnepf和Whiteley克隆了第一个编码δ-内毒素的crylAal基因，截止2008年6月已发现和克隆了412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、对人畜无害[DeMaagd R.A.，Bravo A.，Crickmore N.How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize the insect world.Trends Genet，2001，17：193～199.]，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。

但随着Bt制剂的大量使用及转基因作物的大面积种植，靶标昆虫逐渐产生抗性，继续从自然界中分离具有高毒力的新型Bt cry基因难度不断增加，通过分子设计、蛋白质工程等新的技术对现有的Cry毒素进行改造成为了研究热点。但目前尚没有一个技术可以实现Cry蛋白的定向进化。定点突变和结构域互换，需要在已知杀虫晶体蛋白蛋白结构与功能的关系的前提下进行设计；通过随机突变和基因重组建立突变库，突变率和重组率难于控制，导致突变体少，无有益突变，或者突变库庞大，无法进行生物活性测定。因此，建立一个突变率可控的cry蛋白定向进化技术对于获得高毒力的cry基因具有重要意义。

2000年，本实验室的宋福平等人从Bt菌株Bt c007中克隆了一种新类型的crylI基因。crylIe基因(专利号：CN1401772)该基因编码分子量为81kD的蛋白质，由719个氨基酸组成(Song et al.，2003)。作为国内发现的第一个Bt模式cry基因，crylIe对玉米螟、小菜蛾等鳞翅目害虫活性较高，与目前全球广泛商业化应用的CrylA等蛋白无交互抗性，现在正在用于国内转基因抗虫玉米的研制，具有良好的应用前景。但CrylIe蛋白的毒力与实际应用仍有一定差距。因此，通过分子设计的方法提高CrylIe对鳞翅目害虫活性具有重要的理论和实践意义。

发明内容

针对上述领域中的不足，依据Taq DNA聚合酶在合成碱基时的固有误差和突变特性，建立一种突变率可控的随机突变文库的方法。通过对苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CrylIe的定向进化进行的研究，得到活性显著提高的突变株，并且占整个突变体库的13.16％。针对高毒力突变株突变位点人工合成的突变体，杀虫活性是来突变CrylIe的1000倍。

建立可控突变率突变库的方法，步骤如下：

A、确定突变条件：

(1)确定替换率：将起始模板进行梯度稀释，实时荧光定量PCR扩增，最低浓度的指数扩增最大循环数下可以得到最多的突变体；挑取最低浓度下的若干克隆测序，得到每个克隆平均突变碱基数，按式(I)计算替换率，

替换率＝每个克隆平均突变碱基数/(突变目的片段碱基数×最大循环数)；(I)

(2)确定预替换碱基数目所需的指数扩增循环数C1、C2、C3......，按式(II)计算：