[发明专利]建立可控突变率突变库的方法与应用

权利要求书

1.建立可控突变率突变库的方法，步骤如下：

A、确定突变条件：

(1)确定替换率：将起始模板进行梯度稀释，实时荧光定量PCR扩增，最低浓度的指数扩增最大循环数下可以得到最多的突变体；挑取最低浓度下的若干克隆测序，得到每个克隆平均突变碱基数，按式(I)计算替换率，

替换率＝每个克隆平均突变碱基数/(突变目的片段碱基数×最大循环数)；(I)

(2)确定预替换碱基数目所需的指数扩增循环数C1、C2、C3......，按式(II)计算：

循环数＝预期替换碱基数目/(突变目的片段碱基数×替换率)(II)

其中C1、C2、C3分别代表预替换碱基数目为1、2、3时所需指数扩增循环数，

(3)确定所需起始模板量：实时荧光定量PCR扩增处于指数扩增的最大循环数与步骤(2)中确定的循环数C1、C2、C3......相比较，最接近的该PCR扩增所用模板量确定为所需起始模板量T1、T2、T3......

其中T1、T2、T3分别代表预替换碱基数目为1、2、3时PCT扩增所需起始模板量，

B、可控突变率突变库的建立：按照确定的循环数C1、C2、C3......和对应确定的起始模板量T1、T2、T3......，将起始模板PCR扩增得到可控突变率突变库L1、L2、L3......，所述L1、L2、L3分别代表平均替换碱基数为1、2、3的突变库。

2.根据权利要求1所述的建立可控突变率突变库的方法，所述起始模板为含有编码CrylIe蛋白的核苷酸片段的载体。

3.根据权利要求2所述的建立可控突变率突变库的方法，所述起始模板为含有编码CrylIe蛋白的核苷酸片段的质粒。

4.根据权利要求3所述的建立可控突变率突变库的方法，所述质粒为pAclIe，由pUC19克隆载体，crylAc启动子，crylIe基因全长组成。

5.根据权利要求4所述的建立可控突变率突变库的方法，所述预期替换碱基数目为1、2、3，可控突变率突变库为L1、L2、L3。

6.根据权利要求1-5任一所述方法得到的突变库L1、L2、L3......。

7.权利要求6所述的突变库中的突变体，所述突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO1，其氨基酸序列为SEQ IDNO12；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO2，其氨基酸序列为SEQ ID NO13；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO3，其氨基酸序列为SEQ ID NO14；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO4，其氨基酸序列为SEQ ID NO15；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO5，其氨基酸序列为SEQ ID NO16；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO6，其氨基酸序列为SEQ ID NO17；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO7，其氨基酸序列为SEQ ID NO18；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO8，其氨基酸序列为SEQ ID NO19；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO9，其氨基酸序列为SEQ ID NO20；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO10，其氨基酸序列为SEQ ID NO21；

或突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO11，其氨基酸序列为SEQ ID NO22。

8.一个人工突变体，其氨基酸序列为将权利要求7的突变体中的任一两个以上氨基酸的替换位叠加后得到。

9.根据权利要求8所述的人工突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO24；其核苷酸序列为SEQ ID NO23，或者其氨基酸序列为SEQ ID NO26，核苷酸序列为SEQ ID NO25；其氨基酸序列为SEQ ID NO28，核苷酸序列为SEQ ID NO27。

10.权利要求7、8、9任一突变库中的突变体或是人工突变体在杀害鞘翅目害虫中的应用。