[发明专利]一种广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是用于寄生虫病快速检测技术中的一种广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法。

背景技术

广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)最早是由我国著名的陈心陶教授首次在广州家鼠肺血管内发现并命名的。螺、蛞蝓是主要的中间宿主，人因进食了含有广州管圆线虫幼虫的生或半生的螺肉而感染广州管圆线虫病，又称嗜酸性粒细胞增多性脑脊髓膜炎。广州管圆线虫幼虫主要侵犯人体中枢神经系统，表现为脑膜和脑炎、脊髓膜炎和脊髓炎，可使人致死或致残。临床主要症状为急剧的头痛，甚至不能受到任何震动，走路、坐下、翻身时头痛都会加剧，伴有恶心呕吐、颈项强直、活动受限、抽搐等症状，重者可导致瘫痪、死亡。诊断治疗及时的情况下，绝大多数病人预后良好。极个别感染虫体数量多者，病情严重可致死亡，或留有后遗症。广州管圆线虫病广泛流行于我国台湾、广东、浙江、黑龙江等地，近年来在北京、浙江温州、福建等地均有爆发流行，严重危害人体健康，应引起广泛的重视。

广州管圆线虫感染常用的检测方法包括病原学检查和免疫学诊断，病原学检查主要是脑脊液中查广州管圆线虫虫体，但概率很小。从我国目前的病例统计看，病原检出率仅为4.8％；免疫学诊断方法中的抗体检测特异性不高，不能区分现症和既往感染，与其他寄生虫存在着交叉反应，而抗原的检测虽然特异性较强，但敏感性不高。为有效控制广州管圆线虫病，需要建立高度敏感、特异和简便的检测技术。聚合酶链反应(PCR)具有极高的灵敏度和特异性，并已应用于多种寄生虫病的诊断，但PCR需要精密仪器的配套使用，无法满足基层和现场检测的需求。

Notomi T等在2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环媒恒温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其原理是利用Bst(Bacillus stearothermophilus)大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP由F1C和F2组成；BIP由B1C和B2组成)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。

LAMP技术从2003年开始逐步用于医学检测，目前主要是应用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断，应用环介导等温DNA扩增技术(LAMP)快速检测广州管圆线虫18s rRNA基因目前国内外文献尚无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温DNA扩增技术(LAMP)检测广州管圆线虫高灵敏度、高特异性的检测方法，使其操作简便、成本低廉，结果易于观察，适用于广州管圆线虫的现场快速检测。

本发明是根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理，针对广州管圆线虫的特异性片段设计4条引物，识别靶序列的6个区域，利用BstDNA酶的链置换特性，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构；设计扩增广州管圆线虫18s rRNA基因的4条特异性引物：

FIP：5’-CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG-3’

BIP：5’-GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT-3’

F3：5’-TTGTCGAGGAGCTTCCCG-3’

B3：5’-CACCAACTAAGAACGGCCAT-3’

提取样品DNA后，环介导等温扩增(LAMP)反应体系扩增靶DNA，LAMP检测体系由一套设计的引物、10×LAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成，并对LAMP反应条件进行优化，特异性和重复性检验证实该方法可靠性强。

本发明的广州管圆线虫LAMP检测试剂包括LAMP反应液，与4条LAMP引物共同构成LAMP检测体系，25μl LAMP检测体系的具体配置为：

25ul LAMP反应体系的具体配置：

F3、B3                                      0.1～0.2μM

FIP、BIP                                    1.2～1.6μM

dNTP                                        1.4～2.8mM

Mg2+                                        6～16mM