[发明专利]一种广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法

权利要求书

1.一种广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于根据恒温核酸扩增方法的技术原理，针对广州管圆线虫的特异性片段设计4条引物，识别靶序列的6个区域，利用BstDNA酶的链置换特性，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构；设计扩增广州管圆线虫18s rRNA基因的4条特异性引物为：

FIP：5’-CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG-3’

BIP：5’-GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT-3’

F3：5’-TTGTCGAGGAGCTTCCCG-3’

B3：5’-CACCAACTAAGAACGGCCAT-3’

提取样品DNA后，环介导等温扩增(LAMP)反应体系扩增靶DNA，环介导等温扩增(LAMP)检测体系由一套设计的引物、10×LAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成，并对LAMP反应条件进行优化。

2.根据权利要求1所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于四条LAMP引物的广州管圆线虫LAMP检测试剂，还包括LAMP反应液，与四条LAMP引物共同构成LAMP检测体系，25μl LAMP检测体系的具体配置为：

F3、B3                                      0.1～0.2μM

FIP、BIP                                    1.2～1.6μM

dNTP                                        1.4～2.8mM

Mg2+                                        6～16mM

反应缓冲液10×ThermoPol Reaction Buffer

链置换DNA聚合酶BstDNA polymerase            8U

甜菜碱betaine                               1.0～1.6M

3.根据权利要求2所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于所述试剂的检测反应条件为：63℃恒温60分钟，80℃5分钟终止反应。

4.根据权利要求3所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于扩增结果的检测可以直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀，出现白色沉淀为阳性结果，未出现白色沉淀为阴性结果。

5.根据权利要求4所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于反应后的混合液中加入染色剂SYBR Green-I，出现绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。

6.根据权利要求4所述的广州管圆线虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于，另一种检测结果的方法是取反应后的混合液2μl，加入0.5μl溴酚蓝上样缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100伏，时间为30分钟，溴化乙锭(EB)染色剂染色后在紫外灯下观察，出现梯度条带为阳性结果，如未出现则为阴性结果。