[发明专利]基于荧光图像的抗肿瘤转移药物的筛选方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物筛选与评价方法领域，涉及应用荧光探针特异性标记细胞、细胞显微图像自动获取、荧光图像识别及数据生成，通过分析图像信息来获取药物抑制肿瘤细胞迁移的相关指标并用于药物(化学合成药物和天然产物)抗肿瘤细胞迁移作用的筛选和评价，对于新的抗肿瘤转移药物的发现具有重要意义。

背景技术

肿瘤已成为人类面临的一大杀手，死亡率仅次于心血管疾病，而且呈逐年上升的趋势。目前肿瘤治疗主要以抑制肿瘤细胞的增值为靶点，但有相当一部分肿瘤细胞对于这种类型的化疗药物并不敏感，并且这些活性化合物多数是作用于核酸的合成和功能，对正常组织有较大损伤，易出现恶心，呕吐等副作用。侵袭和转移是肿瘤最基本的生物学特征，也是引起肿瘤患者死亡的主要原因，因肿瘤死亡的患者中约有90％是肿瘤转移引起的。肿瘤细胞的定向迁移是肿瘤转移过程中的关键步骤。因此，寻找有效的抗肿瘤细胞迁移活性物质对于发现新的抗肿瘤药物至关重要。

近年来，基于荧光染色技术的检测分析方法是应用于药物高通量、高内涵筛选的重要方法之一。荧光显微系统的应用解决了普通显微镜对细胞、细胞器的形态和活力方面相对微弱的改变难以观察的问题，被应用于药物研究的多个方面，如药物细胞毒测定和药物相互作用研究等。但目前基于荧光成像技术，以肿瘤细胞迁移，侵袭为靶点的抗肿瘤转移药物高通量筛选还未见报道。

目前，体外测定药物抗肿瘤细胞迁移能力常用的方法有两种：一种是划痕法，另一种是Boyden Chamber或Transwell小室法。划痕法是通过测量创伤边界的缩窄率和计数迁移经过初始创伤边界的细胞，从而对细胞迁移进行量化表征；Boyden Chamber或Transwell小室法是通过计数穿过微孔膜的细胞数量来量化表征细胞迁移。这些方法都是以细胞计数作为细胞迁移能力的判断指标，将所有区域的细胞进行计数是非常费时的，但若仅对一些随机视野的细胞进行计数，又会导致结果不可靠。因此，这些方法都存在通量低(一块板只有12个小室)，试剂和药物消耗量大，实验结果易受主观因素影响的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法，是运用一套筛选和评价硬件系统、图像采集控制系统和图像拼接识别系统，通过荧光染料标记发生迁移的肿瘤细胞，测量各药物作用下迁移细胞数变化来实现对抗肿瘤转移药物的评价和筛选。该筛选和评价系统主要由控制系统控制高精度可控电动平台按预设参数精确走位，由相应滤光片过滤得到的激发光对荧光染料标记后的细胞进行激发产生荧光，再通过内制冷高分辨率CCD实时采集图像并同步上传至电脑，所得图像通过拼接和识别系统处理后，将生物信息可视化，并提供相应荧光参数用于抗肿瘤转移药物的评价。硬件系统由荧光成像系统(包括荧光倒置显微镜、包括汞灯控制器、手动操纵杆和调节螺旋)、高精度可控电动平台(包括高精度可控电动平台和平台控制器)、高分辨率CCD和电脑组成。

具体通过以下步骤实现：

(1)Hoechst 33342染色法定量细胞数

Hoechst 33342是一种DNA特异性荧光染料，能穿透细胞膜并对细胞没有太大毒性，它在细胞中与DNA中的A-T序列富集区结合，结合后能发出蓝色荧光。Hoechst 33342常用于细胞凋亡检测和普通的细胞核染色。因此可以通过Hoechst 33342标记细胞来计数细胞数。

(a)准确称取Hoechst 333421mg溶于0.1ml的二甲亚砜(DMSO)中配成浓度为10mg/ml的储备液，分装于0.5ml离心管中，置于-20℃储存。临用前，用PBS稀释储备液至所需浓度。

(b)Hoechst 33342染色定量细胞数法线性范围

取对数生长期的EAhy926细胞，0.25％胰酶消化，离心收集细胞，按40000，30000，20000，10000，5000，3000，1000个/孔(n＝3)的密度梯度接种于96孔细胞培养板中。置于细胞培养箱中常规培养24h使贴壁，取出后用Hoechst33342溶液(10μg/ml溶于PBS中)对肿瘤细胞进行荧光标记，100μl/孔，37℃孵育15min。PBS洗两遍，吸净残余液体。用筛选系统采集荧光图片，拍摄参数为：蓝色荧光滤光片，曝光时间1200ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔摄取6幅图像。所得图像经荧光图像拼接、识别系统处理并统计荧光强度等参数。以每孔统计得到的荧光强度等指标间接反映每孔的细胞数，并绘制细胞数与荧光强度的量效曲线来确定本方法的线性范围。

(2)基于荧光图像筛选具有抗肿瘤转移作用的药物