[发明专利]基于荧光图像的抗肿瘤转移药物的筛选方法及应用

权利要求书

1.一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法，其特征在于，包括由荧光成像系统、高精度可控电动平台、高分辨率CCD和电脑组成的硬件系统，通过荧光染料标记发生迁移的肿瘤细胞，测量各药物作用下迁移细胞数变化来实现，具体通过以下步骤实现：

(1)Hoechst 33342染色法定量细胞数

(a)准确称取Hoechst 333421mg溶于0.1ml的二甲亚砜中配成浓度为10mg/ml的储备液，分装于0.5ml离心管中，置于-20℃储存，临用前，用PBS稀释储备液至所需浓度，

(b)Hoechst 33342染色定量细胞数法线性范围

取对数生长期的EAhy926细胞，0.25％胰酶消化，离心收集细胞，按40000，30000，20000，10000，5000，3000，1000个/孔(n＝3)的密度梯度接种于96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中常规培养24h使贴壁，取出后用Hoechst33342溶液(10μg/ml PBS中)对肿瘤细胞进行荧光标记，100μl/孔，37℃孵育15min，PBS洗两遍，吸净残余液体，用评价和筛选的硬件系统采集荧光图片，拍摄参数为：蓝色荧光滤光片，曝光时间1200ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔摄取6幅图像，所得图像经荧光图像拼接、识别软件处理并统计荧光强度等参数，以每孔统计得到的荧光强度等指标间接反映每孔的细胞数，通过绘制细胞数与荧光强度的量效曲线确定线性范围；

(2)基于荧光图像筛选具有抗肿瘤转移作用的药物

取对数生长期的EAhy926细胞，0.25％胰酶消化后，离心收集细胞，悬浮于4×10⁵/ml的无血清培养基中，接种于96孔Transwell板的上室，50μl/孔，下室均加入150μl完全培养基，常规培养，待筛选组分及阳性药物在种板同时按实验设计终浓度加入上室细胞悬液中，迁移完成后，弃去孔内培养液，用Hoechst 33342溶液(10μg/ml溶于PBS中)对肿瘤细胞进行荧光标记，150μl/孔，37℃孵育15min，小心擦除微孔膜上层的细胞，上下室均用PBS洗两遍，吸净残余液体，用评价和筛选的硬件系统采集荧光图片，拍摄参数为：蓝色荧光滤光片，曝光时间1200ms，物镜放大倍数2.5倍，然后使用荧光图像拼接、识别软件处理图片并统计荧光强度等参数，以药物的迁移抑制率对药物浓度作线性回归，得直线方程，从中求出抑制半数肿瘤细胞迁移的化合物浓度(IC₅₀)，对肿瘤细胞的迁移抑制率大于50％的药物，计算其抑制肿瘤细胞迁移的IC₅₀值，并与阳性对照做比较从而评估其抑制肿瘤转移的活性，计算公式为：

药物对肿瘤细胞的迁移抑制率(％)＝(1-Fm/Fc)×100

其中Fm为加药组的荧光强度，Fc为对照组的荧光强度。

2.根据权利要求1所述的一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法，其特征在于，荧光成像系统主要部分为具有放大经荧光标记的细胞的荧光倒置显微镜。

3.根据权利要求1所述的一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法，其特征在于，步骤(b)所用的是10μg/ml PBS的Hoechst 33342溶液。

4.根据权利要求1所述的一种基于荧光图像的抗肿瘤转移药物评价和筛选方法在抗肿瘤转移药物筛选中的应用。