[发明专利]一种基于AF146527基因的弓形虫PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种弓形虫PCR检测方法。

技术背景

弓形虫是一种专性细胞内寄生虫，可寄生于除红细胞外的所有有核细胞内，可感染包括人类在内的所有温血动物(da Silva RC，Langoni H.Parasitol Res，2009，105(4)：893-898.)。它引起的弓形虫病是一种严重的人兽共患病，其传播与流行传播与流行给畜牧业生产(特别是带来养猪业)巨大的损失(Dorny P，PraetN，Deckers N，et al.Vet Parasitol，2009，163(3)：196-206；Dubey JP.Vet Parasitol，2009，164(2-4)：89-103.)；同时，对于妊娠妇女、AIDS患者，骨髓移植患者、器官移植受者以及包括肿瘤患者在内的免疫力低下群体，弓形虫病则会导致严重的后果，对人类健康存在很大的潜在危害，其防治在艾滋病、移植医学、围产医学等学科中备受关注(Ong EL.Clin Med，2008，8(5)：539-543；Pereira-Chioccola VL，Vidal JE，Su C.Future Microbiol，2009，4：1363-1379；PeyronF.Mem Inst Oswaldo Cruz，2009，104(2)：316-319；Derouin F，Pelloux H；ESCMIDStudy Group on Clinical Parasitology.Clin Microbiol Infect，2008，14(12)：1089-1101)。在临床上，弓形虫感染多为隐形感染，难以用传统常规方法侦检；及时出现临床症状的患者，由于其临床症状复杂多变，且多同时伴有其他病变，亦往往造成诊断困难。目前，弓形虫感染的诊断方法主要为免疫学诊断方法，检测弓形虫抗体，但往往弓形虫病患者伴有免疫功能低下，对于这部分免疫功能低下的患者，往往会出现抗体水平的下降，难以用免疫学方法诊断。而普通病原学检测方法如直接涂片法的检出率低下，动物接种和细胞培养法尽管检出率高，但操作繁琐，周期长，并不适合用于临床诊断。PCR是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，具有操作简单、快速、特异和灵敏的特点。关于弓形虫的PCR诊断方法，国内外学者已经进行了大量的研究，其中B1基因、P30基因及ITS-1基因等均曾被作为PCR诊断的标靶。弓形虫基因组中存在一个529bp的重复序列(AF 146527基因)，其基因组中的拷贝数高达200～300，远远高于上述的PCR诊断标靶，因此，以其作为PCR诊断的标靶可以提高诊断的灵敏性(Homan W L，Vercammen M，DeBraekeleer J，et al.International Journal for Parasitology，2000，30：69-75)。国外学者曾利用该重复序列为标靶建立荧光定量PCR诊断方法，获得较为理想的效果(Homan W L，Vercammen M，De Braekeleer J，et al.International Journal forParasitology，2000，30：69-75；Edvinsson B，Lappalainen M，B，et al.ClinMicrobiol Infect，2006，12(2)：131-136.)。但荧光定量PCR的设备及试剂成本较高，因此，本领域需要一种敏感特异的普通PCR检测方法，以满足实际工作中弓形虫感染诊断的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测弓形虫的PCR方法，通过以下技术方案实现：

(1)设置PCR检测试剂盒，试剂盒包括PCR反应管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、EB染料、溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)；(2)提取被检样本DNA；(3)PCR扩增；(4)扩增产物分析；

其中(1)的PCR反应管内含10×缓冲液、dNTP、引物1、引物2和MgCl2，所述引物1、引物2系根据弓形虫AF146527基因序列(SEQ ID NO.1)设计合成的DNA片段，序列如下：

引物1  5’-TGGAGCCACAGAAGGGACAG-3’(SEQ ID NO.2)

引物2  5’-GCCATCACCACGAGGAAAGC-3’(SEQ ID NO.3)。