[发明专利]一种基于AF146527基因的弓形虫PCR检测方法

权利要求书

1.一种检测弓形虫的PCR方法，其特征包括以下步骤：

(1)设置PCR检测试剂盒，试剂盒包括PCR反应管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、EB染料、溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)；(2)提取被检样本DNA；(3)PCR扩增；(4)扩增产物分析；

其中步骤(1)的PCR反应管内含10×缓冲液、dNTP、引物1、引物2和MgCl₂，所述引物1、引物2系根据下述碱基合成的DNA片段：

引物1  5’-TGGAGCCACAGAAGGGACAG-3’

引物2  5’-GCCATCACCACGAGGAAAGC-3’

所述阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，通过以下方法构建：将以弓形虫基因组DNA为模板，以引物Tox4(5’CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3’)、引物Tox5(5’-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATTT-3’)扩增获得的PCR产物连接于pMD18-T载体后经测序验证获得的阳性质粒，该质粒含有弓形虫AF146527基因片段；

所述阴性对照为去离子水；

其中步骤(2)所述提取被检样品DNA，可采用《分子克隆》描述的经典方法提取，亦可使用上海飞捷生物公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取(或其他生物公司的DNA提取试剂盒提取)；

其中步骤(3)所述的PCR扩增是在PCR管中加入步骤(2)提取的被检样本DNA，同时设阳性对照和阴性对照，反应体系为：10×buffer 5μl，10mM dNTP0.25～1.5μl，25mM MgCl₂2～5μl，引物1(50pmol/μl)1μl，引物2(50pmol/μl)1μl，Taq酶(1U/μl)1μl，模板DNA1μl，加去离子水补足至50μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，56～63℃退火30s，72℃延伸1.5min，共循环30～45次，最后72℃延伸10min；

其中步骤(4)所述扩增产物分析，是将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，被检样本孔出现的电泳条带与阳性对照和阴性对照孔对比，以判断阳性或阴性。

2.根据权利要求1所述检测弓形虫的PCR方法，其特征在于PCR反应体系的最佳组成为10×buffer 5μl，10mM dNTP 1μl，25mM MgCl₂2μl，引物1(50pmol/μl)1μl，引物2(50pmol/μl)1μl，Taq酶(1U/μl)1μl，模板DNA 1μl，加去离子水补足至50μl。

3.根据权利要求1所述检测弓形虫的PCR方法，其特征在于PCR最佳反应条件为94℃预变性5min后，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1.5min，共循环30次，最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述检测弓形虫的PCR方法，其特征在于检测样品中弓形虫的应用。