[发明专利]一种鉴别猪、牛、羊肉及其制品的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪、牛、羊肉及其制品的鉴别方法，具体地说，涉及一种利用DNA分析鉴别猪、牛、羊肉及其制品的方法。

背景技术

目前，对于特殊动物成分的物种鉴定方法主要有三种：酶联免疫吸附测定法ELISA(enzyme-linked immuno sorbent assay)，显微镜结构分析方法和DNA分析方法。其中，DNA分析方法是一种较新的鉴定方法，该方法运用了PCR扩增技术(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)，这种技术可以在几个小时的时间内将微量的目的基因成百万倍的扩增，非常灵敏，而且操作简单。由于PCR技术具有以上这些优点，近年来建立了大量基于该技术的分析方法，用于鉴定食品中的物种组成。

PCR技术(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍，其到达平台期(Plateau)所需的循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的反应动力学：PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100％，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内，形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

琼脂糖凝胶电泳技术(Agarose gel Electrophoresis)是以琼脂糖凝胶作为支持介质的区带电泳法。电泳法，是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。