[发明专利]利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白亚单位疫苗的方法及其产品

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白亚单位疫苗的方法及其产品。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus II，PCV2)属于圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属(circovirus)，猪圆环病毒2型(PCV2)感染可损伤猪的免疫系统，引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等猪圆环病毒性疾病(Porcine cirvovirus disease，PCVD)。猪圆环病毒2型(PCV2)开放性阅读框2(ORF2)编码病毒衣壳蛋白(Cap)，大小约为30KDa。Cap蛋白上存在抗原表达位点，具有免疫原性，因此成为PCV2特异性血清学检测方法和亚单位疫苗、核酸疫苗的基础。

专利CN101180406A中，公开了利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中生产PCV2 Cap蛋白的方法。然而，市售的昆虫细胞以及细胞培养基价格昂贵，而且大规模培养细胞需要购置专门的细胞培养生物反应器，投资很大，生产过程中易受环境条件的污染，而且细胞培养获得重组蛋白产物翻译后修饰不能有效进行，细胞培养生产外源蛋白的效率相对比较低。这些都限制了PCV2 Cap蛋白在昆虫细胞中大规模生产和应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白亚单位疫苗的方法，包括以下步骤：

A克隆猪圆环病毒2型衣壳蛋白的ORF2基因，与杆状病毒转移载体连接，获得重组转移载体；

B重组转移载体与杆状病毒共同转染昆虫细胞，培养物上清经噬斑筛选，获得重组杆状病毒；

C重组杆状病毒感染家蚕幼虫或蚕蛹，在家蚕幼虫或蚕蛹中表达重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白；

D回收重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴；

E分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白；

F利用纯化的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白，辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。

优选地，本发明步骤A中猪圆环病毒2型衣壳蛋白的ORF2基因序列包含序列表中的SEQ ID NO1。

优选地，本发明步骤B中所述重组杆状病毒中猪圆环病毒2型ORF2基因的表达受多角体启动子的控制。

优选地，本发明步骤B中所述昆虫细胞包括家蚕卵巢细胞。

优选地，本发明步骤B中所述的杆状病毒包括家蚕核型多角体病毒。

优选地，本发明步骤C中所述的家蚕品种包括箐松×皓月或与之相一致的家蚕品种。

优选地，本发明步骤E中所述的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白序列包含序列表中的SEQ ID NO2。

优选地，本发明步骤E中所述的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白为如下三种多肽的任意一种：

i)选自序列表中的SEQ ID NO2序列的多肽；

ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；

iii)i)和ii)所述多肽的免疫原性部分。

优选地，本发明步骤F中所述的佐剂为水性佐剂或油性佐剂。

本发明另一方面在于使用本发明方法生产的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白。

本发明又一方面在于使用本发明方法的猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白亚单位疫苗。

优选地，本发明方法制备的疫苗每头份包含至少0.5微克重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白。

技术效果

本发明使用了家蚕生物反应器生产PCV2 Cap蛋白，与采用细胞培养的现有技术相比，具有很大的优越性。

首先，我国已有5000多年的养蚕业历史，有丰富的家蚕资源。家蚕易于饲养，成本低廉；其次家蚕生产蛋白，翻译后修饰效率高，并且能分泌到血液中，分离纯化比较容易。而且家蚕的血淋巴具有储存蛋白的能力，淋巴内含有蛋白分解酶的抑制物，对目的蛋白起到保护作用。家蚕生产蛋白的效率要远高于细胞培养表达效率，而且又很容易从家蚕体内分离纯化出来。

其次，本发明构建的重组家蚕核型多角体病毒(BmNPV)，带有完整的PCV2 Cap蛋白目的基因，位于家蚕核型多角体基因启动子控制下，具有极晚期表达和表达量高的优点。利用本发明的家蚕生物反应器生产PCV2 Cap蛋白的方法，安全可靠，适合大规模生产，为大量生产猪圆环病毒2型特异性血清学检测抗原和猪圆环病毒2型疫苗的抗原成分Cap蛋白提供了基础。

附图说明

图1为重组家蚕核型多角体病毒构建流程图；

图2为SDS-PAGE鉴定重组PCV2 Cap蛋白的表达；