[发明专利]超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法

说明书

发明领域

本发明属于分析化学领域，涉及超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法，具体而言，涉及天然产物提取物或单体对组织蛋白酶B体外抑制率以及组织蛋白酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。

技术背景

组织蛋白酶B是溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶，属于木瓜蛋白酶家族，在pH值3.0～7.0都具有催化活性，其特异性底物为Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，组织蛋白酶B催化底物肽键断裂生成7-氨基-4-甲基香豆素。近年来研究表明组织蛋白酶B在肿瘤的发展中起作用的一类关键酶，组织蛋白酶B通过多种机制促进血管形成，从而促进肿瘤生长，同时降解基底膜主要成分以及激活胶原酶、尿激酶等其他蛋白酶发生协同作用使肿瘤易侵袭、转移和扩散，在肿瘤组织中还发现组织蛋白酶B与组织蛋白酶B抑制剂平衡作用也参与肿瘤的发生发展过程。在多种人类肿瘤中都已经发现组织蛋白酶B表达水平上调。组织蛋白酶B已成为肿瘤细胞侵袭和转移相关的重要靶点，有关其抑制剂的研究可能为肿瘤的治疗提供新的手段。

组织蛋白酶B抑制剂的筛选一般使用光谱法，其不足之处在于光谱法易受到背景干扰，可能得到假阳性或假阴性结果(Arjen R.de Boer，Henk Lingeman，Wilfried M.A.Niessen，Hubertus Irth.Trends in Analytical Chemistry，Vol.26，No.9，2007.)。质谱方法最大的优势在于它的检测本质是基于一个分子的质荷比。现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱，串联质谱高度特异性和精确性揭示待分析化合物的结构信息，且质谱方法可以同时检测和定量多种组分(Gejing Deng，Gautam Sanyal.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40(2006)528-538)。酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物，盐和添加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制，样品进入质谱前使用高效液相进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响(Arjen R.de Boer，Thomas Letzel，Danny A.van Elswijk，Henk Lingeman，Wilfried M.A.Niessen，and Hubertus Irth.Anal.Chem.2004，76，3155-3161)。

发明内容

本发明的目的是提供超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法。本发明可用于分析天然产物提取物或单体对组织蛋白酶B体外抑制率以及组织蛋白酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。

本发明所述的天然产物提取物或单体对组织蛋白酶B的体外抑制是指天然产物提取物或单体抑制组织蛋白酶B的活性从而导致酶促反应产物7-氨基-4-甲基香豆素的量减少；

本发明所述的组织蛋白酶催化活性是指在37℃，组织蛋白酶催化底物生成7-氨基-4-甲基香豆素的量。

本发明包括以下内容：以Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素为底物，组织蛋白酶B在37℃催化底物生成7-氨基-4-甲基香豆素，用超高效液相色谱和质谱联用对7-氨基-4-甲基香豆素进行定量。

本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法，所述的组织蛋白酶B抑制剂是天然产物提取物或单体，其包括以下步骤：

(1)酶促反应缓冲液的配制

缓冲液包括0.4摩尔/升醋酸钠，4毫摩尔/升乙二胺四乙酸，8毫摩尔/升二硫苏糖醇，用醋酸调pH值为5.5；

(2)标准品的配制

用甲醇将标准品分别配成浓度为100纳摩尔/升、200纳摩尔/升、500纳摩尔/升、1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素作为内标；所述的标准品为7-氨基-4-甲基香豆素；

(3)对照品和样品的酶促反应

对照品：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升的组织蛋白酶B，在37℃孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升的底物Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，37℃反应20分钟后，加入1％(v/v)三氟乙酸终止反应，同时加入终浓度为1微摩尔/升的内标7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素，作为对照品；供超高效液相色谱/质谱测定；