[发明专利]超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法

权利要求书

1.一种超高效液相色谱和质谱联用筛选组织蛋白酶B抑制剂的方法，所述的组织蛋白酶B抑制剂是天然产物提取物或单体，其特征在于，包括以下步骤：

(1)酶促反应缓冲液的配制

缓冲液包括0.4摩尔/升醋酸钠，4毫摩尔/升乙二胺四乙酸，8毫摩尔/升二硫苏糖醇，用醋酸调pH值为5.5；

(2)标准品的配制

用甲醇将标准品分别配成浓度为100纳摩尔/升、200纳摩尔/升、500纳摩尔/升、1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素作为内标；所述的标准品为7-氨基-4-甲基香豆素；

(3)对照品和样品的酶促反应

对照品：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升的组织蛋白酶B，在37℃孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升的底物Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，37℃反应20分钟后，加入1％(v/v)三氟乙酸终止反应，同时加入终浓度为1微摩尔/升的内标7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素，作为对照品；供超高效液相色谱/质谱测定；

样品：反应总体积100微升，终浓度8纳摩尔/升的组织蛋白酶B与终浓度为2微摩尔/升的组织蛋白酶B抑制剂于37℃孵育30分钟，加入终浓度20微摩尔/升的底物Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，37℃反应20分钟后，加入1％(v/v)三氟乙酸终止反应，同时加入终浓度为1微摩尔/升的内标7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素，作为样品；供超高效液相色谱/质谱测定；

(4)标准品、对照品和样品的检测

对标准品检测：采用7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取7-氨基-4-甲基香豆素m/z＝176.0712及7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素m/z＝206.0817的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以7-氨基-4-甲基香豆素与7-氨基-4-甲氧基香豆素峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为100纳摩尔/升至20微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到7-氨基-4甲基香豆素的线性方程：

y＝ax+b

式中，y为所述的标准品7-氨基-4-甲基香豆素与内标7-氨基-4-甲氧基香豆素峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R²；

①超高效液相色谱的检测条件

超高效液相色谱仪：安捷伦RRLC1200SL；

色谱柱：安捷伦ZORBAX Extend-C18(2.1*50毫米，1.8微米)；

流动相：甲醇(A)和水(B)；

梯度洗脱程序：0～8分钟，30％A～55％A；8～8.1分钟，55％A～30％A；8.1～13分钟，30％A；

流速：0.7毫升/分钟；

进样量：10微升；

②质谱条件

质谱仪：安捷伦6520；

离子源：大气压化学电离源(APCI)正离子模式；

毛细管电压：3500伏特；

气体温度：350摄氏度；

雾化器温度：350摄氏度；

干燥气流速：5升/分钟；

雾化气气压：275.8千帕；

碎裂电压：175伏特；

锥孔电压：65伏特；

对照品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；

(5)抑制剂对组织蛋白酶的抑制率

分别根据对对照品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品和样品中7-氨基-4-甲基香豆素浓度，抑制剂对组织蛋白酶的抑制率按照以下公式计算：

I_样品＝(C_对照-C_样品)/C_对照×100％

式中，I为抑制剂对组织蛋白酶的抑制率，C_对照为根据线性方程求得的对照品中7-氨基-4-甲基香豆素浓度，量纲为微摩尔/升、C_样品为根据线性方程求得的样品中7-氨基-4-甲基香豆素浓度，量纲为微摩尔/升。