[发明专利]一种产乳酸工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产乳酸工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明还涉及一种产乳酸工程菌的应用，特别是发酵生产乳酸，属于发酵工程领域。

背景技术

作为一种重要的平台化合物，L-乳酸的需求随着石油资源的枯竭而不断增加。在L-乳酸合成工艺中，以生物质为原料采用微生物发酵(乳酸菌和霉菌)的工艺具有广泛的应用。然而由于乳酸菌营养需求高和难以耐受恶劣环境胁迫，以及霉菌易形成菌丝团和副产物较多等原因，限制了L-乳酸发酵产业的发展。Saccharomy cescerevisiae作为模式微生物具有：(1)作为单细胞微生物，易利用简单培养基快速生长；(2)存在单倍体与双倍体两种形式而易于基因工程改造和筛选；(3)可通过多种代谢工程策略进行生长或代谢表型改造；(4)具有丰富的单倍体和二倍体单基因缺失菌株；(5)具有丰富的生理功能信息(SGD)和组学分析技术等优点，为L-乳酸的微生物制造提供了菌株平台。但由于S.cerevisiae自身的基因特性决定其不能过量合成L-乳酸，为此需要借助代谢工程策略，引入外源乳酸脱氢酶(LDH)基因，同时沉默PDC1，使丙酮酸节点的代谢流流向L-乳酸途径，同时降低副产物乙醇的积累以提高乳酸的转化率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产乳酸工程菌。

所述产乳酸工程菌基因组中携带外源乳酸脱氢酶(LDH)基因且沉默了丙酮酸脱羧酶(PDC1)基因。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述产乳酸工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

1)克降Bovine LDH基因；

2)克隆PDC1基因上下游序列；

3)融合PCR构建两端为PDC1基因的上下游序列，中间为LDH基因的同源重组片段；

4)将步骤3)得到的同源重组片段导入受体菌；

5)验证所述工程菌。

步骤4)中所述受体菌为酵母菌。

所述酵母菌为低产乳酸，高产乙醇酵母菌。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种所述产乳酸工程菌在发酵生产乳酸中的应用。

发酵生产丙酸的工艺为：30℃、200r/min摇瓶培养所述工程菌至对数中期，以8％接种量接种入发酵罐；发酵参数为：pH 5.5，通气量1.5L/min，溶氧50％。

本发明利用同源重组的方法，获得一株高产乳酸工程菌。用本发明提供的工程菌生产乳酸，可以突破乳酸菌及霉菌生产的瓶颈，简单易行，发酵100h后乳酸产量达15g/L。

附图说明

图1pY13TEF1-LDH物理图谱及其菌落PCR验证

A：pY13TEF1-LDH物理图谱

B：pY13TEF1-LDH菌落PCR验证

M：Market 1-7：pY13TEF1-LDH阳性转化子  8：阴性对照  9：阳性对照

图2同源重组片段PDC1启动子-LDH-CYC1-His3-PDC1下游序列的构建

(A)：融合PCR示意图；(B)：PDC1启动子、LDH-CYC1-His3及PDC1下游序列的独立扩增电泳图.M：DNA marker；1：PDC1下游序列；2：LDH-CYC1-His3；3：PDC1启动子.；(C)：LDH整合表达片段电泳图.M：DNA marker；1：LDH整合表达片段

图3同源重组表达示意图

图4产乳酸工程菌验证

(A)：PCR验证引物示意图；

(B)CEN.PK2-1C和工程菌CENPK2-1C[LDH]的PCR验证电泳图.M1：1kb markers；1：引物YZ5和YZ6以CEN.PK2-1C为模板；2：引物YZ5和YZ6以CENPK2-1C[LDH]为模板；3：引物YZ4和YZ7以CEN.PK2-1C为模板；4：引物YZ4和YZ7以工程菌为模板；5：引物YZ3和YZ7以CEN.PK2-1C为模板；6：引物YZ3和YZ7以工程菌为模板；7：引物YZ1和YZ2以CEN.PK2-1C为模板；8：引物YZ1和YZ2以工程菌为模板。

图5乳酸产量对比

图6乙醇产量对比

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克降手册所述的条件进行操作。

实施例1产乳酸工程菌的构建

1、克隆Bovine LDH基因