[发明专利]一种大肠杆菌胞内表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌胞内表达的表达载体，属于基因工程领域。本发明还涉及该新型表达载体在色氨酸生产中的应用，属于发酵工程领域。

背景技术

近年来，随着氨基酸等重要代谢产物的市场需求迅猛增长，促进这些重要代谢产物积累的胞内表达载体受到了越来越多的重视，并成功地表达了多种重要代谢产物的关键酶基因。大肠杆菌胞内表达的原理是：将目标终端产物代谢途径中的一个或几个关键酶基因，插入至胞内表达载体的启动子序列之后，由于表达产物是终端代谢产物的重要前体物，从而促进终端代谢产物的积累。此外，由于胞内表达酶在胞内已经空间折叠成具有天然构象的活性蛋白，因此无需考虑酶的跨膜运输过程，表达稳定高效。

为了促进代谢终端产物的积累，就需要选择合适的胞内表达载体，表达终端产物的一个或几个关键前体物基因。虽然已经有了许多胞内表达载体可供选择，但是这些载体大多或多或少地具有如下特点：(1)多拷贝数，强启动子；这就造成外源基因表达量过高，在胞内形成大量包涵体，从而抑制了细胞本身的活力。同时相应关键酶的过量表达使得终端产物的合成代谢通道在关键酶所在位置形成拥堵，影响菌株本身活力的同时，终端产物的积累也受到了影响。(2)IPTG诱导；在工业化应用中一方面由于IPTG本身价格昂贵，使得终端产物生产成本大幅增加；另一方面，IPTG在后续的产品提取中很难完全去除，因此很难在食品和医药类产品的生产过程中使用，这就大大限制了载体的应用范围。(3)单启动子表达；菌体内某一重要代谢产物的积累，往往是其合成途径中多个关键基因共同表达的结果，而单个启动子在表达多个基因时，基因的表达量会受到影响。

Zhou，H.Y.，et al.公布了一种载体(Enhanced 1-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheA(fbr)and aroF(wt).Bioresour Technol.2010，101(11)：4151-6.)，其携带有野生型aroF基因(aroFwt)和pheAFbr，用于生产L-苯丙氨酸，3L发酵后，携带有此载体的菌株L-苯丙氨酸产量仅提高2.81倍，表达效率还是有待提高。

本发明构建了一种通用性好的新型胞内表达载体，引入修饰的外源基因aroF^Fbr及抗色氨酸反馈调控的trp操纵子基因(trpE^FbrDCBA)，应用于色氨酸生产，表达产量提高达50倍。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌胞内表达载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述表达载体的物理图谱如图1所示。

所述表达载体复制子，抗性标记基因，阻遏蛋白基因及双启动子。

所述抗性标记基因为卡那霉素抗性基因。

所述复制子为p15A。

所述两个多克隆位点为MCS1和MCS2。

所述阻遏蛋白基因为λcItS857。

所述双启动子为λ噬菌体PL、PR双启动子。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述表达载体的应用。

为解决上述技术问题，采用的技术方案为：

使用上述表达载体，构建衍生表达载体pSV03，用于色氨酸生产。

所述色氨酸生产包括如下步骤：将质粒pSV03转化至大肠杆菌W3110的衍生菌JW3686(E.coli Genetic Stock Center，Yale University)。挑选卡那霉素抗性单克隆菌落，选用通用的LB培养基35～37℃培养，当OD值达到3以上时，按照5～10％的接种量，转接至装液量为1.2～1.5L的3L发酵罐中，30～33℃培养至对数生长前期，升温至37～39度开始诱导产色氨酸；发酵一般是24～48h，更佳地为30～36h，pH值控制在6.8～7.2。

所述表达载体pSV03的物理图谱如附图2所示。

所述表达载体pSV03含有修饰的外源基因aroF、抗色氨酸反馈调控的trp操纵子基因(trpE^FbrDCBA)。

所述修饰的基因aroF通过定点突变技术，缺失突变了由aroF编码的DAHP合成酶氨基酸序列中的第十一个氨基酸Lie，从而获得了抗色氨酸反馈调节的aroF^Fbr基因。

可用于本发明的宿主细胞宜为原核细胞，最佳的为大肠杆菌。