[发明专利]同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒与制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物病毒检测试剂盒，尤其是涉及一种同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒与制备方法。

背景技术

兰花病毒多达20多种，其中以建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)最为普遍，危害最严重。由于兰花病毒无法使用药剂进行防治，因此如何尽早检测兰花病毒，剔除带病兰花，成为目前最主要的防治途径。

公开号为CN1975427、CN1975428、CN1975425、CN1975426、CN101294962的中国专利申请分别采用斑点酶联、双抗夹心酶联和胶体金试纸条等血清学技术建立建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒检测技术；但是涉及的检测技术无法克服血清学检测方法的缺陷，存在灵敏度低和大量假阴性样品无法检出等缺点；仅仅能够满足日常生产检测需要，对于病毒含量较低的样品，难于有效进行检测。因此在兰花生产过程中采用以上发明的检测技术只能够对发病前的样品进行检测、筛选，对于病毒的防治仅仅是治标，无法从根本上解决病毒问题。

只有通过高灵敏度的病毒检测技术筛选真正无毒的植株作为母本进行种苗的生产，才能从根本上解决病毒的问题。目前，有关高灵敏度病毒检测方法，最为成熟的技术就是RT-PCR检测方法，该方法能够检测的最低病毒浓度为500Copies/mL，相当于每毫升样品液含2fg病毒，检测灵敏度达到血清学技术的10⁶倍。因此该方法是目前最为可靠的病毒检测技术，能够满足无毒扩繁母株的筛选，从而生产无毒种苗，从根本上解决病毒的危害问题。但是由于该方法检测成本非常高，按每个样品检测两种病毒进行两次RT-PCR的话，就需要1000元人民币检测费用，非常昂贵。再加上由于现在病毒泛滥，通常都需要通过检测10份以上的样品，才有机会得到一株无毒母株。由于企业无法承担高昂的成本种苗，因此最终只能通过继续生产普通种苗充斥兰花产业，造成恶性循环。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的病毒检测技术存在灵敏度低、需要分次检测、费用较高等问题，提供一种能够在一次检测过程中同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒及其使用方法。

所述同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒由以下试剂组成：

试剂A：RT反应液，含有M-MuLV逆转录酶缓冲液、随机引物、dNTP。

试剂B：M-MuLV逆转录酶。

试剂C：PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP、检测引物。

试剂D：Taq聚合酶。

试剂E：对照品。

所述5XM-MuLV逆转录酶缓冲液为5～10μL，所述随机引物(0.1uM)为1～2μL，所述dNTP(10mM)为0.5～1μL。

所述PCR缓冲液为2.5～5μL，所述MgCl₂(25mM)为2.5～5μL，所述dNTP(10mM)为0.5～1μL，所述检测引物(0.1uM)为1～2μL；所述检测引物的序列如下：

CyMV上游引物：5′-GCTACCGCCGCCATCGTCAT-3′

CyMV下游引物：5′-GCGCAGCACGTTCACGGTCA-3′

ORSV上游引物：5′-CCACCGAACTTACTGAAGCA-3′

ORSV下游引物：5′-TGTCGTAAGGTTGACCACTC-3′。

所述对照品分为阳性对照和阴性对照，阳性对照为带有两种病毒的冻干兰花叶片粉末，阴性对照为无两种病毒的冻干兰花叶片粉末。

所述两种兰花病毒为建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)。

所述同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒的使用方法如下：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。

1)逆转录：即cDNA合成。总体积25μL，RNA经94℃预变性5min后置于冰浴中待测，取RNA 1μL、试剂A 23.5μL、试剂B 0.5μL。于37℃水浴反应1小时合成cDNA。

2)扩增检测：总体积25μL，其中cDNA 1μL，同时检测两种病毒的PCR反应液23.5μL、试剂D 0.5μL。

3)取反应产物5μL按常规琼脂糖凝胶电泳测定扩增条带大小。