[发明专利]同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒与制备方法

权利要求书

1.同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

试剂A：RT反应液，含有M-MuLV逆转录酶缓冲液、随机引物、dNTP；

试剂B：M-MuLV逆转录酶；

试剂C：PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP、检测引物；

试剂D：Taq聚合酶；

试剂E：对照品。

2.如权利要求1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在于所述5XM-MuLV逆转录酶缓冲液为5～10μL，所述随机引物为1～2μL，所述dNTP为0.5～1μL。

3.如权利要求1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在于所述PCR缓冲液为2.5～5μL，所述MgCl₂为2.5～5μL，所述dNTP为0.5～1μL，所述检测引物为1～2μL。

4.如权利要求1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在于所述检测引物的序列如下：

CyMV上游引物：5′-GCTACCGCCGCCATCGTCAT-3′

CyMV下游引物：5′-GCGCAGCACGTTCACGGTCA-3′

ORSV上游引物：5′-CCACCGAACTTACTGAAGCA-3′

ORSV下游引物：5′-TGTCGTAAGGTTGACCACTC-3′。

5.如权利要求1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在于所述对照品分为阳性对照和阴性对照，阳性对照为带有两种病毒的冻干兰花叶片粉末，阴性对照为无两种病毒的冻干兰花叶片粉末。

6.如权利要求1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在于所述两种兰花病毒为建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)。

7.如权利要求1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照；

1)逆转录：即cDNA合成。总体积25μL，RNA经94℃预变性5min后置于冰浴中待测，取RNA 1μL、试剂A 23.5μL、试剂B 0.5μL。于37℃水浴反应1小时合成cDNA；

2)扩增检测：总体积25μL，其中cDNA 1μL，同时检测两种病毒的PCR反应液23.5μL、试剂D 0.5μL；

3)取反应产物5μL按常规琼脂糖凝胶电泳测定扩增条带大小。

8.如权利要求7所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒的使用方法，其特征在于在步骤2)中，所述扩增检测采用二温式PCR，具体程序如下：94℃变性5min；然后94℃45s，68℃100s，25个循环；最后72℃延伸5min。