[发明专利]一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型鉴别的多重PCR试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明属于口腔致病菌的检测领域，具体涉及一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型鉴别的多重PCR试剂盒及使用方法。

背景技术

牙周病是指发生在牙支持组织的疾病，包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织的牙周炎两大类。是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病之一。我国成年人中80％～97％患有不同程度的牙周疾病。近来越来越多的研究表明，牙周病与许多系统性疾病如，血管疾病、糖尿病、低体质量早产儿、消化系统疾病等存在着密切的相关性，成为许多系统性疾病的潜在危险因素。牙周病作为慢性、非特异性、感染性疾病，其主要感染源为细菌。而牙龈卟啉菌(P.gingivalis)是牙周病的重要致病菌，与慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿和牙髓感染以及伴发性全身性系统疾病密切相关。P.gingivalis是革兰阴性短杆菌，专性厌氧、无芽胞、无动力。基因组G+C含量为40～52％。研究已证实P.gingivalis存在毒力株和无毒株，无毒株形成了口腔正常的微生态群，而毒力株则成为牙周病的重要致病菌。1999年Curtis等在对P.gingivalis W50菌株的研究中发现，其外膜上存在着一个由重组活化基因(recombination activation gene，rag)B编码的相对分子质量为5.5×10⁴的免疫显性表面抗原。该基因位于ragA基因的上游，两者为共转录基因，ragA基因编码假定的tonB依赖性受体，同时也发现rag基因座(ragA和ragB)，仅存在于毒力株中，有利于P.gingivalis在牙周组织中的的定植与致病。Hall等发现，rag基因座有4种等位基因型，存在遗传多态性，其中rag-1型为高毒力基因型。然而，P.gingivalis遗传的多态性给该菌的诊断及清除带来了巨大的挑战，迄今为止，临床并无有效地的诊断试剂盒问世。因此P.gingivalis诊断及亚型鉴别诊断试剂盒的发明，对于防治牙周疾病的发生，提高人民生活质量具有重要意义。

发明内容

P.gingivalis是一种重要的口腔致病菌，存在着致病型与非致病型。非致病型P.gingivalis构成了口腔正常的微生物群，而致病型P.gingivalis存在rag基因座。Rag基因座有四种不同的基因型，其致病能力不同。目前对该菌的诊断主要依靠培养，培养需时常、步骤繁琐，不利于临床快速诊断的需求，同时培养出的细菌需要进行进一步的PCR鉴定才能够区分出致病型与非致病型。本发明提供一种快速、简便的方法不仅能够鉴别出有无P.gingivalis感染而且还能够同时鉴定出其亚型。

本发明针对目前P.gingivalis诊断耗时长，步骤繁琐，不利于临床快速诊断的需求。通过Clustral X比对设计出针对P.gingivalis以及四种不同rag基因型的特异性引物，保证这些引物扩增片段大小具有明显不同、且具有相同的退火温度。把这五种不同的引物与Taq酶、buffer、dNTP和ddH₂O混合做成mix(反应混合液)。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型鉴别的多重PCR试剂盒，主要成分是下述5种针对牙龈卟啉菌16s rRNA的特异性引物，还包括其他PCR试剂；

针对牙龈卟啉菌16s rRNA的特异性引物如下：

Forward primer：5’-AGG CAG CTT GCC ATA CTG CG-3’(SEQ ID NO.1)

Reverse primer：5’-ACT GTT AGC AAC TAC CGA TGT-3’(SEQ ID NO.2)

rag1(W50)，

Forward primer：5’-CGC GAC CCC GAA GGA AAA GAT T-3’(SEQ ID NO.3)

Reverse primer：5’-CAC GGC TCA CAT AAA GAA CGC T-3’(SEQ ID NO.4)

rag2(Thai)，

Forward primer：5’-GCT TTG CCG CTT GTG ACT TGG-3’(SEQ ID NO.5)

Reverse primer：5’-CCA CCG TCA CCG TTC ACC TTG-3’(SEQ ID NO.6)

rag3(QML)，

Forward primer：5’-CCG GAA GAT AAG GCC AAG AAA GA-3’(SEQ ID NO.7)