[发明专利]诱导干细胞向胰岛样细胞分化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及体外诱导干细胞向胰岛样细胞定向分化的方法及胰岛样细胞的用途。

背景技术

糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体作缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。临床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。细胞治疗是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治疗策略，对于已经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的β细胞或其替代物是最理想的治疗方法。近几年，胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难却极大的限制了这种疗法的应用。

干细胞具有极强自我更新能力及多向分化潜能，是基因治疗的理想靶细胞。干细胞分为全能干细胞(如胚胎干细胞，可以分化为机体所有组织细胞)、多能干细胞(具有多向分化潜能，可以分化为多种组织细胞，如间充质干细胞等)和专能干细胞(维持某一特定组织细胞的单一方向自我更新，如肠上皮干细胞等)。干细胞技术的不断突破及干细胞本身所具有的特性使人类有可能在体外培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织工程以供临床所需，以此为目的的干细胞工程涉及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的大多数医学难题，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于人羊水、脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的作用。

神经元限制性沉默因子(Neuronal restrictive silencer factor，NRSF)是一分子质量为116kD的Cys2/His2型锌指蛋白，属于Gli-Kruppel样转录因子家族。整个分子包含N端阻遏结构域RD-1、近N端锌指结构、DNA结合区域(含7个排列成簇的锌指结构)、赖氨酸富含区、脯氨酸富含区、C端阻遏结构域RD-2(含一个锌指结构)。NRSF广泛表达于胚胎干细胞及成体细胞中，仅在成熟神经元和胰岛细胞中没有表达。NRSF可以调控与胰岛发育成熟相关的重要基因，同时，NRSF和β细胞的葡萄糖-胰岛素分泌偶联机制密切相关，NRSF过表达破坏这种偶联机制并导致细胞减少。因此，NRSF下调表达可以促进细胞向胰岛细胞分化。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。研究发现，利用携带有RNA聚合酶III启动子的质粒载体操纵一段小的发夹shRNA在哺乳动物细胞中表达同样能够引起特定靶基因的沉默。

慢病毒载体(lentiviral vectors)系统具有如下特点：病毒不具备自身复制能力，具有自身灭活机制；宿主范围广，人、鼠等多种属多类型细胞都能被高效感染；在稳定整合宿主基因组的基础上增加了高效感染静止期细胞，高效表达外源蛋白，同时还能逃避甲基化抑制的特点。在慢病毒载体的基础上改造出来的慢病毒干涉载体能够在细胞内对靶基因产生长期稳定的干涉效果。

对干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌胰岛素的细胞，是治疗I型糖尿病的理想策略之一，而下调表达干细胞中的NRSF，并且用诱导培养基对其进行诱导，有可能使我们获得能分泌胰岛素的细胞。因此，分离不同组织来源的成体干细胞，将其在体外诱导分化为胰岛样细胞作为种子细胞用于胰岛细胞移植、微囊化干细胞制剂等的制备，同时诱导分化的胰岛样细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。此方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是建立体外诱导干细胞分化为胰岛样细胞的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

利用干细胞具有多向分化的潜能，诱导其向胰岛样细胞分化，诱导分化的细胞可分泌胰岛素，为胰岛细胞移植、微囊化干细胞制剂的制备提供种子细胞，同时诱导分化的细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。