[发明专利]提高产1，3-丙二醇融合菌筛选效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用基因组重排技术制备产1，3-丙二醇基因工程融合菌的筛选方法，特别是提高基因工程融合菌筛选效率的方法，属于工业生物技术领域。

背景技术

1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工和医药中间体原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、乳化剂、抗冻剂等。PDO最主要的用途，是合成新型聚酯高分子材料聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)的单体。PTT是目前国际上公认的六大石化新产品之一。与聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)和尼龙等比较，PTT具有良好的印染特性、富有弹性、抗紫外线、静电性能好、可生物降解并再生利用等多种优良特性，因此PTT在纺织服装业、地毯装饰业、工程塑料等众多领域有着十分广阔的应用前景。据估计，目前仅我国每年就需求PDO上百万吨，而且在未来十年我国对PDO的需求量还将继续增大。PTT生产的关键在于单体原料PDO的来源，其生产成本直接影响着PTT的工业化生产和应用规模。

1，3-丙二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法目前仅有国外DuPont和Shell公司以及国内的少数几家单位在进行小规模工业化生产。技术路线分别是德国Degussa公司的丙烯醛合成法专利技术和Shell公司开发的环氧乙烷合成法，并用于聚合生产PTT。为了垄断市场，这两家跨国公司不对外销售用于PTT生产的PDO，而只向客户销售PTT切片及其下游产品。同时，化学合成法存在设备投资大、工艺要求严格、操作条件苛刻、有毒副产物多、产品提取难度大、三废处理成本高以及生产原料依赖于不可再生的石油资源等问题，导致PTT材料及其原料产品PDO的价格一直居高不下，制约其进一步的发展。而微生物发酵法生产PDO，以可再生资源——碳水化合物为原料，具有操作简便、反应条件相对温和、副产物少、污染少且容易处理以及成本低廉等优点，引起了国内外相关企业和研究单位的高度重视，将具有广泛的应用前景和开发潜力。

微生物发酵法的生产方法包括：一是利用从自然界获得的菌株以甘油为底物直接发酵生产1，3-丙二醇；二是构建基因工程菌以葡萄糖或甘油为底物发酵生产1，3-丙二醇；基因工程菌构建策略主要有5种：

(1)强化原始菌株中还原途径限速酶的表达及阻止副产物的代谢途径；

(2)将1，3-丙二醇生产菌的关键酶基因dhaB、dhaT基因克隆到甘油生产菌中，以希望能获得将葡萄糖转化为1，3-丙二醇的基因工程菌；

(3)将甘油生产菌的DAR1、GPP2基因克隆到1，3-丙二醇生产菌中，以希望能获得将葡萄糖转化为1，3-丙二醇的基因工程菌；

(4)将产1，3-丙二醇的dha调控子基因克隆到大肠杆菌中，获得能转化甘油为1，3-丙二醇的基因工程菌；

(5)将1，3-丙二醇生产菌的关键酶基因dhaB、dhaT基因和甘油生产菌的DAR1、GPP2基因克隆到大肠杆菌中，从而获得能将葡萄糖转化为1，3-丙二醇的基因工程菌。

目前，国外DuPont公司已经在大肠杆菌中成功构建了以葡萄糖为底物发酵1.3-丙二醇的途径，产量高达135g/L。国内众多研究机构也纷纷针对产1，3-丙二醇途径中的关键酶进行了深入的研究，在模式大肠杆菌成功表达关键酶基因，但产量水平较低，而针对原始生产菌株肺炎克雷伯氏菌的基因工程手段改造鲜见报道，随着国际范围内生物柴油工业的广泛兴起，将产生大量的剩余副产品甘油，为利用发酵法制备1，3-丙二醇提供了丰富的原料。

基因组重排技术作为新型的育种技术，基于原生质体融合技术之上，使不同基因组发生重排的过程。其主要机制在于利用原生质体融合达到全基因组片段交换、重组，经过多轮递归融合后促使正向突变表型聚集，相较诱变育种、原生质体融合人技术等，基因组重排技术具有更高的效率。

其次，基因组重排技术可以无需了解相关微生物的代谢途径、关键酶的表达基因、转录调控等知识背景，尤其适合微生物代谢途径的遗传改造。尽管DNA重组技术可以在多亲本之间发生基因重排，但改变的是基因片段而不是整个基因组。微生物细胞的表型受代谢要求，能源利用，环境压力、全基因组水平表达而决定的，所以通过几个特殊基因的定向改造是很难达到菌株表型的优化。而基因组重排技术是全基因组工程策略，在无需知道基因组信息及代谢网络信息情况下，就可以运用于菌株改良。此外，基因组重排技术操作简单，容易推广，不需要昂贵的实验仪器，而且见效快。因此，基因组重排育种很适合工业菌株的改造工程，不仅体现成本经济效应，还具备高效性。