[发明专利]检测百日咳杆菌的引物组、检测试剂盒以及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其是涉及一种可以通过PCR扩增方法对百日咳杆菌进行精确核酸检测的引物组、以及包括该引物组的试剂盒和检测方法。

背景技术

目前用于诊断百日咳感染的实验室检测方法主要包括细菌培养法、血清学检测和分子生物学的检测方法。培养法特异性非常高，被认为是百日咳诊断的“黄金标准”(Gold standard)。但其灵敏度低，耗时长，工作强度大，不适合用于早期诊断。百日咳毒素抗体检测特异性高，但一般在病程10天左右检测阳性率高，故早期诊断比较困难。且一些免疫缺陷、免疫系统尚未发育完善的患儿不能对病原体产生正常的免疫应答。

百日咳毒素(pertussis toxin)是鲍特氏百日咳杆菌的主要毒力因子。有S1～S5 5种不同的亚基，其中S1最为重要，通过抑制Gi(G Protein)，进而影响机体生理功能。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可以单独扩增百日咳杆菌IS481基因或PT基因的引物对，或者通过双重PCR同时对百日咳杆菌IS481基因和PT基因进行扩增的双重PCR引物组，解决现有技术存在的缺陷。

本发明所述引物组为：IS481基因扩增引物对，引物对序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；和/或PT基因扩增引物对，引物对序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

本领域的普通技术人员，可以对本发明所述的IS481基因扩增引物对和/或PT基因扩增引物对进行某一个碱基或者几个碱基进行突变，获得与本发明所述的IS481基因扩增引物对和/或PT基因扩增引物对功能相同或者基本相同的引物组。

本发明的目的之二在于提供一种含有本发明目的之一所述的引物组的检测试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一种百日咳杆菌的检测方法，包括通过本发明目的之一所述的百日咳杆菌的引物组进行PCR扩增待检测样品获得核酸检测样品。

优选-的方案是：所述的PCR扩增为包括IS481基因扩增引物对和PT基因扩增引物对组成的引物组进行双重PCR扩增。

更优的方案是：所述的PCR扩增步骤为：

(1)配制PCR反应体系，扩增模板最后加入反应体系中；

(2)PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃15s，60℃15s，72℃15s，30个循环，72℃延伸5min；

(3)凝胶电泳检测扩增产物。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明中以百日咳毒素S1亚基中的插入序列IS481和启动子序列PT作为目标基因。插入序列IS481具有50-200个拷贝，作为核酸检测目标基因具有很高的灵敏性，但也有报道发现在其他鲍特氏菌中也存在IS481序列，特异性有待进一步论证。因此，又选择了百日咳杆菌中具有高度特异性并且只有一个拷贝的PT序列作为第二个目标基因。

现在有很多分子生物学检测手段是荧光定量PCR方法，虽然可以减少污染机会，但是所需设备昂贵，成本也相应增加，仅适合在较大型医疗机构和研究机构进行。本发明在同一反应体系中同时检测出两个基因，而且通过凝胶电泳即可检测。既保证了检测的特异性、提高了检测的敏感性，同时大大提高了检测效率、节省检测成本。所需设备简单，操作简便快速，适合在各级医疗机构开展百日咳的早期诊断。

附图说明

图1为本发明双重PCR凝胶电泳结果示意图。

图2为IS481基因PCR凝胶电泳结果示意图。

图3为PT基因PCR凝胶电泳结果示意图。

图4为本发明实施例6特异性检测PCR凝胶电泳结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1引物组的制备

通过对Genbank数据库中百日咳杆菌IS481基因和PT基因进行比对分析，设计扩增引物对，IS481基因引物对序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；PT基因扩增引物对，引物对序列为SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4。

实施例2百日咳杆菌双重PCR检测试剂盒的制备

试剂盒的组成：

IS481基因扩增引物：

P15’-gatgtcggtggcgctgtt-3’(SEQ ID NO：1)，

P25’-gagaaactggaaatcgcca-3’(SEQ ID NO：2)；

PT基因扩增引物：