[发明专利]用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的引物组及检测体系

说明书

技术领域

本发明涉及一种用环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测肠道病毒的引物组、检测体系、检测方法及用途。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)属于小核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)病毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)，是多种人类疾病的致病病原，致病谱广，可引起呼吸道感染、结膜炎、心肌炎、心肌病及神经系统的疾病，偶尔引起新生儿死亡。1948年Dolldorf和Sickles在纽约市柯萨奇镇一次脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)流行期间，通过接种乳鼠首次分离出CV。迄今为止，共有30个血清型，分成A、B两组；其中，CVA组16型(CV Group A 16Strain，CVA16)是引起儿童手足口病(Hand，Foot，and Mouth Disease，HFMD)的主要病原之一。肠道病毒的传统检测方法为先将病毒分离培养，然后进行血清中和试验定型分类，此法繁琐、耗时、费力，虽然多数培养结果可在1周内得到，但中和试验却十分费时、昂贵，甚至有时无法定型。PCR方法具有快速、敏感性强、特异性高等诸多优点，已应用于肠道病毒的检测，但由于需要昂贵的仪器设备和较高检测费用，以及对检测人员较高的技术要求，因而使其不适用于现场快速检测及和基层普及应用。

LAMP技术是由Notomi等于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术缩短了核酸扩增时间，提高了扩增效率，并且具有更高的灵敏度、特异性，降低了仪器设备及检测条件的要求，被公认为具有较强实用性的分子检测技术。目前，LAMP技术已经成功应用于多种病毒的检测，如SARS冠状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒等，但尚未见该方法在柯萨奇病毒A16型检测方面的应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供了一种用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的引物组；

本发明的第二个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系。

本发明的第三个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的方法。

本发明的第四个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系的用途。

本发明的技术方案概述如下：

用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的引物组，它由序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQ IDNO.4所示核苷酸序列组成。

用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系，该体系由下述原料组成：

10×的ThermoPol缓冲液1.25μL；

25mmol/L的Mg²⁺ 0.5μL-1μL；

5mol/L的Betaine 0.5μL-2μL；

10mmol/L的dNTP 1μL-2μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.25μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.25μL；

100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.2μL；

100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.2μL；

8U/μL的Bst酶0.5μL；

加超纯水至总体积为11μL。

用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的方法，它包括下述步骤：

(1)提取待检测样品中的病毒RNA并逆转录为cDNA；(2)取1.5μL所述cDNA加入到11μL的用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系中，10000转/分钟，离心30秒；(3)加入20μL矿物油，于63℃恒温中进行环介导恒温扩增技术扩增1-1.5小时；(4)取出反应管，加入SYBR Green Ⅰ型核酸染料，若反应液变成绿色，则说明待测样品中存在柯萨奇病毒A16型，若为桔黄色，则说明待测样品中不存在柯萨奇病毒A16型，所述用环介导恒温扩增技术检测柯萨奇病毒A16型的检测体系由下述原料组成：

10×的ThermoPol缓冲液1.25μL；

25mmol/L的Mg²⁺ 0.5μL-1μL；

5mol/L的Betaine 0.5μL-2μL；