[发明专利]HPV6型L2N120E7E6融合蛋白基因、表达载体、方法、菌株和用途

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域。具体地，本发明涉及一种表达人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的基因、表达载体、方法和免疫治疗及预防用途。 

背景技术

生殖器疣(Genital Wart，GW)是目前世界上发病率很高的性传播疾病之一。虽然GW一般不会导致死亡，但是会使患者产生心理阴影，并带来昂贵的治疗费用。目前治疗GW的方法主要有：抗增殖药物、冷冻疗法、损毁性疗法、免疫调节剂等，这些方法引起的不适应症和疣复发很常见，没有从根本上使疾病治愈，这就需要寻找更为有效的免疫预防和治疗GW的方法。 

GW与人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染的密切关系早已明确，HPV感染是其主要的致病因子。HPV是一组嗜上皮组织的小双链DNA病毒，目前已发现100多个型别，其中50种与生殖器感染有关，可通过性接触传播。HPV具有严格的种属特异性和组织特异性，仅感染人的皮肤和粘膜上皮，引起上皮的增生性改变。临床上根据其致病性分为高危型和低危型，前者能诱发宫颈上皮组织的不良性增生甚至宫颈癌变，后者可引起生殖器周尖锐湿疣和喉部的乳头瘤，其中引起生殖器疣的以HPV-6、HPV-11型为主。 

有证据表明，宿主的免疫应答，尤其是细胞免疫应答水平，是影响HPV相关疾病形成的主要因素。体液免疫应答产生的中和抗体能够抑制HPV的感染和进一步扩散，细胞免疫应答能够清除HPV感染的细胞以及相关的肿瘤细胞。 

HPV的生活周期决定其最小程度将病毒抗原暴露于免疫系统的特性，故与其他病毒相比，HPV感染激发的人体免疫应答很弱。在GW治疗中发 现，在大多数免疫功能健全的患者中，自然或医源性因素导致病灶免疫原暴露于免疫系统后，邻近的疣体能够消退。这提示能够利用疫苗来激发机体的免疫系统，以达到预防和治疗GW的目的。 

HPV预防性和治疗性疫苗早在九十年代初就已经在开始研制。目前预防性疫苗已取得了重要进展，其免疫策略主要集中在如何诱发出针对HPV相关表位的高滴度中和抗体来预防感染。在这方面，以HPV衣壳蛋白L1，L2为靶抗原的病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，在动物实验和临床试验中均表现出良好的预防HPV感染的效果。其中较为成功的有Merck公司的HPV16/18/6/11四价疫苗Gardasil和GSK公司的HPV16/18二价疫苗Cervarix.，二者已分别于2006年和2008年被美国FDA批准进入市场。 

治疗性疫苗，特别是低危型治疗性疫苗的研究较少，进展也相对缓慢，治疗性疫苗主要通过诱发机体产生针对病毒抗原的细胞免疫，从而清除被病毒感染的细胞及相关病灶。由于HPV早期蛋白E6，E7在病毒生活周期及相关肿瘤组织中持续存在，已经成为了多数治疗性疫苗选择的靶抗原。各种以E6、E7蛋白为靶抗原的治疗性疫苗在动物实验上均表现出良好的细胞免疫反应。 

GSK研制的HPV6型L2E7治疗性疫苗在Ⅱ期临床中证实对感染HPV6型的生殖器疣(GW)有一定的治疗效果。该HPV6型L2E7蛋白为HPV6型L2全长基因与E7基因融合，L2全长蛋白只能诱导较弱的体液免疫和细胞免疫反应，全长的L2蛋白(459个氨基酸)与E7蛋白融合形成的结构可能影响了E7蛋白(98个氨基酸)在细胞内的水解，从而影响到E7蛋白的T细胞表位的有效呈递。 

因此，还需要开发新的有强的免疫效果的治疗及预防生殖器疣的疫苗。 

发明内容

下面详细讨论本发明各种技术方案的制备和使用，但应该理解，本发明提供了许多适用的发明构思，其可以体现在各种各样的具体方面上。 

为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语可用于说明的具体实例的一般类别，但它们的使用不限制本发明，权利要求中所概括的除外。 

除非另外指出，本文所述的“HPV”是指人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)； 

除非另外指出，本文所述的“bp”是指碱基对(base pair)； 

除非另外指出，本文所述的“ELISPOT”是指酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot)； 

除非另外指出，本文所述的“ICS”是指胞内细胞因子染色(Intracellular Cytokine Staining)；