[发明专利]一种固定化酶整体毛细管色谱柱及其制备方法和应用

说明书

(一)技术领域

本发明属色谱柱制备技术，特别涉及一种固定化酶整体毛细管色谱柱及其制备和应用。

(二)背景技术：

固定化酶色谱柱的制备，目前国内外已有开展。现有技术的制备方法是以颗粒载体固定酶，装柱而成。颗粒载体种类较多，可以是大孔吸附树脂，离子交换树脂，也可以是葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等。固定酶的方式有吸附法，如大孔树脂固定酶，也有共价交联法，如葡聚糖固定酶。由于颗粒载体固定酶再装柱，因而，无法制成柱径在1毫米以下的毛细管固定化柱。颗粒载体固定酶色谱柱主要应用于亲和层析分离，分离纯化与柱中固定的酶具有亲和力的成分。固定化酶整体毛细管色谱柱目前国内外均处于研究阶段，固定化材料与毛细管的选用有较多种类，应用领域也处于探索之中。

(三)发明内容

本发明的目的是制备一种可应用于筛选与酶具有亲和作用的化合物的固定化酶整体毛细管色谱柱。为提高筛选灵敏度，采用溶胶凝胶法固定酶，制成整体毛细管柱。

本发明采用的技术方案是：

一种固定化酶整体毛细管色谱柱，所述的固定化酶整体毛细管色谱柱按照以下方法制备得到：

(1)将四乙氧基硅烷与甘油以质量比1∶0.2～0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷质量2～3％的强酸性离子交换树脂，在35～45℃下，搅拌混合72～120小时，然后过滤除去强酸性离子交换树脂，取滤液减压蒸馏除去甘油与反应生成的乙醇(通常在真空度300Pa、25℃温度下进行减压蒸馏)，得到改性硅烷，改性硅烷中加入改性硅烷质量1.2～1.6倍的水和改性硅烷质量1.5～2.5％的1mol/L的磷酸溶液，混匀得到改性硅烷溶液；

(2)在浓度40mmol/L、pH值为7.0～7.5的磷酸缓冲液中加入平均分子量为400～1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液中聚乙二醇的浓度为70～90mg/mL，酶的浓度为90～100mg/mL，将含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液与步骤(1)得到的改性硅烷溶液以质量比1∶1混合，搅拌均匀后得混合液，用注射器注入所述的混合液预处理过的玻璃毛细管中，注满后静置5～10分钟，然后将玻璃毛细管浸入40mmol/L、pH值7.0的磷酸缓冲液中，于3～7(优选～5℃)下静置7～9天，制得所述固定化酶整体毛细管色谱柱，所述酶为胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管紧张素转化酶。

所述预处理过的玻璃毛细管按照以下方法制备得到：玻璃毛细管用无水乙醇浸泡1～3小时后，用注射器将体积百分比浓度为10％的氨丙基三乙氧硅烷的无水乙醇溶液注入毛细管中，注满后静置30～40分钟，再用无水乙醇冲洗干净，于90℃烘箱烘干30～40分钟，制得所述预处理过的玻璃毛细管，所述玻璃毛细管的内径为0.2～1.0毫米，管长通常为5～20厘米。

所述步骤(1)中，所述强酸性离子交换树脂优选732型强酸性离子交换树脂、717型强酸性离子交换树脂、D001型强酸性离子交换树脂或D201型强酸性离子交换树脂。

本发明还提供一种固定化酶整体毛细管色谱柱的制备方法，所述的方法包括以下步骤：

a、玻璃毛细管用无水乙醇浸泡1～3小时后，用注射器将体积百分比浓度为10％的氨丙基三乙氧硅烷的无水乙醇溶液注入毛细管中，注满后静置30～40分钟，再用无水乙醇冲洗干净，于90℃烘箱烘干30～40分钟，制得预处理过的玻璃毛细管，所述玻璃毛细管的内径为0.2～1.0毫米，管长为5～20厘米；

b、将四乙氧基硅烷与甘油以质量比1∶0.2～0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷质量2～3％的强酸性离子交换树脂，在35～45℃下，搅拌混合72～120小时，然后过滤除去强酸性离子交换树脂，取滤液减压蒸馏除去甘油与乙醇(通常在真空度300Pa、25℃温度下进行减压蒸馏)，得到改性硅烷，改性硅烷中加入改性硅烷质量1.2～1.6倍的水和改性硅烷质量1.5～2.5％的1mol/L的磷酸溶液，混匀得到改性硅烷溶液；