[发明专利]一种固定化酶整体毛细管色谱柱及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述的固定化酶整体毛细管色谱柱按照以下方法制备得到：

(1)将四乙氧基硅烷与甘油以质量比1∶0.2～0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷质量2～3％的强酸性离子交换树脂，在35～45℃下，搅拌混合72～120小时，然后过滤除去强酸性离子交换树脂，取滤液减压蒸馏除去甘油与生成的乙醇，得到改性硅烷，所述改性硅烷中加入改性硅烷质量1.2～1.6倍的水和改性硅烷质量1.5～2.5％的1mol/L的磷酸溶液，混匀得到改性硅烷溶液；

(2)在浓度40mmol/L、pH值为7.0～7.5的磷酸缓冲液中加入平均分子量为400～1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液中聚乙二醇的浓度为70～90mg/mL，酶的浓度为90～100mg/mL，将含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液与步骤(1)得到的改性硅烷溶液以质量比1∶1混合，搅拌均匀后得混合液，用注射器将所述的混合液注入预处理过的玻璃毛细管中，注满后静置5～10分钟，然后将玻璃毛细管浸入40mmol/L、pH值7.0的磷酸缓冲液中，于3～7℃下静置7～9天，制得所述固定化酶整体毛细管色谱柱，所述酶为胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管紧张素转化酶。

2.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述预处理过的玻璃毛细管按照以下方法制备得到：玻璃毛细管用无水乙醇浸泡1～3小时后，用注射器将体积百分比浓度为10％的氨丙基三乙氧硅烷的无水乙醇溶液注入毛细管中，注满后静置30～40分钟，再用无水乙醇冲洗干净，于90℃烘箱烘干30～40分钟，制得所述预处理过的玻璃毛细管，所述玻璃毛细管的内径为0.2～1.0毫米。

3.如权利要求2所述的固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述玻璃毛细管的管长为5～20厘米。

4.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述强酸性离子交换树脂为732型强酸性离子交换树脂、717型强酸性离子交换树脂、D001型强酸性离子交换树脂或D201型强酸性离子交换树脂。

5.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述步骤(1)中，所述取滤液减压蒸馏是在真空度300Pa、25℃温度下进行减压蒸馏。

6.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱的制备方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：

a、玻璃毛细管用无水乙醇浸泡1～3小时后，用注射器将体积百分比浓度为10％的氨丙基三乙氧硅烷的无水乙醇溶液注入毛细管中，注满后静置30～40分钟，再用无水乙醇冲洗干净，于90℃烘箱烘干30～40分钟，制得预处理过的玻璃毛细管，所述玻璃毛细管的内径为0.2～1.0毫米，管长为5～20厘米；

b、将四乙氧基硅烷与甘油以质量比1∶0.2～0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷质量2～3％的强酸性离子交换树脂，在35～45℃下，搅拌混合72～120小时，然后过滤除去强酸性离子交换树脂，取滤液在真空度减压蒸馏除去甘油与乙醇，得到改性硅烷，改性硅烷中加入改性硅烷质量1.2～1.6倍的水和改性硅烷质量1.5～2.5％的1mol/L的磷酸溶液，混匀得到改性硅烷溶液；

c、在浓度40mmol/L、pH值为7.0～7.5的磷酸缓冲液中加入平均分子量为400～1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液中聚乙二醇的浓度为70～90mg/mL，酶的浓度为90～100mg/mL，将含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液与步骤b得到的改性硅烷溶液以质量比1∶1混合，搅拌均匀后得混合液，用注射器将所述的混合液注入步骤a制得的预处理过的玻璃毛细管中，注满后静置5～10分钟，然后将玻璃毛细管浸入40mmol/L、pH值7.0的磷酸缓冲液中，于3～7℃下静置7～9天，制得所述固定化酶整体毛细管色谱柱，所述酶为胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管紧张素转化酶。

7.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱应用于筛选与所述固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用的化合物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：待筛选化合物用水配成浓度小于1μg/mL的三种不同浓度的样品溶液，分别用注射泵注入含有待验亲和作用的酶的固定化酶整体毛细管色谱柱中，控制流速4μL/min，跟踪检测流出液中待筛选化合物的浓度，当流出液中待筛选化合物的浓度与样品溶液的初始浓度相同时，记录为浓度平衡时间，若三种不同浓度的样品溶液的浓度平衡时间相同，表示待筛选化合物与固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶无亲和作用，若三种不同浓度的样品溶液的浓度平衡时间有差别，表示待筛选化合物与固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用。