[发明专利]利用三尖杉培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞培养技术，具体的说是一种诱导三尖杉液体悬浮培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法，同时产物中包括一个新的化合物。

背景技术

松香烷二萜类化合物属于三环二萜类化合物，是一类重要的天然化合物。这类化合物之所以引起人们的研究兴趣主要是因为它们中的很多物质具有良好的活性，很多民间用药中含有这类物质。比如，本发明中的hinokiol(化合物2)对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等具有抑制作用，是很好的抗菌先导化合物。然而，目前这类化合物主要来源于从植物中提取，关于其化学合成的报道很少，且还处于实验室研究阶段。由于这类化合物在植物中的含量很低，获得困难，大大限制对其进一步的研究和应用。

利用植物细胞培养技术生产生物活性物质因其环境友好、生产周期短、可控性强等优点日益受到人们的重视，成为天然活性物质的潜在来源。而目前人们遇到的主要问题是怎样调控植物的代谢途径进而获得预期的产物，像控制化学合成一样来控制生物合成。

目前常见的调控方法主要是促进细胞中已经存在的次生代谢产物的生产，也就是提高其产率。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用三尖杉(Cephalotaxus fortunei，Hook，f.)液体悬浮培养细胞，以诱导剂诱导和吸附剂吸附相结合的联合调控技术生物合成7种松香烷二萜类化合物，包括一个新的松香烷二萜化合物的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

将三尖杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50～150g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中同时加入浓度为10～2000μM的诱导剂和50～200g的吸附剂，所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子；继续培养7～14天后，分别收获细胞和吸附剂；

第一次提取：室温下，将真空抽滤后的吸附剂先用极性或中等极性有机溶剂提取2～5次；合并提取液，过滤，旋转蒸干；

第二次提取：在蒸干的粗提物中加入低浓度的碱液以及等体积的非极性有机溶剂萃取，粗提物与低浓度的碱液质量体积比例1g∶3～15ml；

分离纯化：萃取8～16小时后，将有机层分离出来，将有机层旋转蒸干，然后置于硅胶柱上分离，所用硅胶为200～300目硅胶，洗脱方式为梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积为200-800ml，用样品瓶连续收集洗脱液，每个样品瓶收集5-15ml洗脱液，同时利用薄层色谱对样品瓶收集的洗脱液进行检测，当所用的洗脱液为环己烷-乙酸乙酯(8∶1，v/v)时，分别得到化合物1和4的粗品；环己烷-乙酸乙酯(5∶1，v/v)时，分别得到化合物3和6的粗品；环己烷-乙酸乙酯(2∶1，v/v)时，分别得到化合物2、5和7的粗品。将这7个化合物的粗品分别置于凝胶柱上完成进一步的纯化，得到7个化合物的纯品。这7个化合物分别为：

化合物1：3-hydroxy-2-isopropyl-6-methyl-5-(4-methyl-3-oxopentyl)naphthalene

化合物2：abieta-8，11，13-triene-3β，12-diol

化合物3：12-hydroxyabieta-6，8，11，13-tetraene-3-one

化合物4：abietatriene-3β-ol

化合物5：11，12-dihydroxy-8，11，13-abietatriene-3，7-dione

化合物6：11-hydroxy-12-methoxyabieta-8，11，13-triene-3，7-dione

化合物7：3β，11-dihydroxy-12-methoxyabieta-8，11，13-triene-7-one

三尖杉培养细胞的常用培养基组成为，于MS基础培养基中添加终浓度为0.1～2.5mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸，0.1～1mg/L激动素以及10～50g/L蔗糖，pH值为5.4～6.2；

细胞指数生长初期是细胞接种于培养基后的第4～10天。

三尖杉细胞的培养条件为：旋转式摇床，转速80～150rpm，培养温度为20～30℃，暗培养；培养周期为14～25天，每隔14～21天传代一次。

非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸、茉莉酸或茉莉酸甲酯；吸附剂为对萜类化合物具有较强的吸附能力并对细胞无毒的大孔吸附树脂，包括XAD-7HP，XAD-4，XAD-1600或HP2MG。