[发明专利]利用三尖杉培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法

权利要求书

1.利用三尖杉培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法，其特征在于：将三尖杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50～150g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中同时加入终浓度为10～2000μM的诱导剂和50～200g的吸附剂，所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子；继续培养7～14天后，分别收获细胞和吸附剂；

第一次提取：室温下，将真空抽滤后的吸附剂先用极性或中等极性有机溶剂提取2～5次；合并提取液，过滤，旋转蒸干；

第二次提取：在蒸干的粗提物中加入低浓度的碱液以及等体积的非极性有机溶剂萃取，粗提物与低浓度的碱液质量体积比例1g∶3～15ml；

分离纯化：萃取8～16小时后，将有机层分离出来，将有机层旋转蒸干，然后置于硅胶柱上分离，所用硅胶为200～300目硅胶，洗脱方式为梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积为200-800ml，用样品瓶连续收集洗脱液，每个样品瓶收集5-15ml洗脱液，同时利用薄层色谱对样品瓶收集的洗脱液进行检测，当所用的洗脱液为环己烷-乙酸乙酯(8∶1，v/v)时，分别得到化合物1和4的粗品；环己烷-乙酸乙酯(5∶1，v/v)时，分别得到化合物3和6的粗品；环己烷-乙酸乙酯(2∶1，v/v)时，分别得到化合物2、5和7的粗品；将这7个化合物的粗品分别置于凝胶柱上完成进一步的纯化，得到7个化合物的纯品；这7个化合物分别为：

化合物1：

3-hydroxy-2-isopropyl-6-methyl-5-(4-methyl-3-oxopentyl)naphthalene

化合物2：abieta-8，11，13-triene-3β，12-diol

化合物3：12-hydroxyabieta-6，8，11，13-tetraene-3-one

化合物4：abietatriene-3β-ol

化合物5：11，12-dihydroxy-8，11，13-abietatriene-3，7-dione

化合物6：11-hydroxy-12-methoxyabieta-8，11，13-triene-3，7-dione

化合物7：3β，11-dihydroxy-12-methoxyabieta-8，11，13-triene-7-one

2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述三尖杉培养细胞的常用培养基组成为，于MS基础培养基中添加终浓度为0.1～2.5mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸，0.1～1mg/L激动素以及10～50g/L蔗糖，pH值为5.4～6.2；

所述细胞指数生长初期是细胞接种于培养基后的第4～10天。

3.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述三尖杉细胞的培养条件为：旋转式摇床，转速80～150rpm，培养温度为20～30℃，暗培养；培养周期为14～25天，每隔14～21天传代一次。

4.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸、茉莉酸或茉莉酸甲酯；

所述吸附剂为对萜类化合物具有较强的吸附能力并对细胞无毒的大孔吸附树脂，包括XAD-7HP，XAD-4，XAD-1600或HP2MG。

5.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述第一次提取时所用的极性或中等极性的有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯；

每次提取过程中，吸附剂与有机溶剂质量体积比例1g∶3-15ml，每次提取先采用振荡提取30分钟～3小时，然后超声提取10～60分钟。

6.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述第二次提取时所用的低浓度的碱液是指体积浓度为0.1～1％的氨水、质量浓度为0.05～0.5％的氢氧化钠或质量浓度为0.05～0.5％的氢氧化钾；

所述第二次提取时所用的非极性溶剂是指氯仿或二氯甲烷。

7.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述硅胶柱的洗脱液梯度组成依次为环己烷、环己烷-乙酸乙酯(60～10∶1，v/v)、环己烷-乙酸乙酯(8∶1，v/v)、环己烷-乙酸乙酯(5∶1，v/v)、环己烷-乙酸乙酯(3∶1，v/v)、环己烷-乙酸乙酯(2∶1，v/v)、环己烷-乙酸乙酯(1∶1，v/v)、乙酸乙酯。

8.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述凝胶柱的填料为Sephadex^TMLH-20；所用洗脱液为甲醇或体积比1∶1的甲醇-二氯甲烷。