[发明专利]一种核酸检测方法及其专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及核酸杂交和检测技术。

背景技术

核酸杂交技术是基因芯片及其他核酸检测领域的重要技术，普通的核酸杂交方法是将探针与样本基因进行一次杂交，可较特异和快速地获得样本基因的信息，但由于设计的探针不够特异和样本基因中含有与靶基因序列相似的基因等原因，会发生非特异杂交，使检测结果出现假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核酸检测的试剂盒，利用该试剂盒可以减少核酸检测结果的假阳性。

本发明提供的试剂盒包括：

捕获探针，所述捕获探针包括由20-50个核苷酸组成的单链核酸片段A，所述单链核酸片段A与待测核酸片段的区域片段A’完全反向互补或完全相同，所述单链核酸片段A的3’末端是所述捕获探针的3’末端；

和杂交探针，所述杂交探针包括由20-30个核苷酸组成的单链核酸片段B，所述单链核酸片段B与待测核酸片段的区域片段B’完全反向互补或完全相同，所述单链核酸片段B的5’末端是所述杂交探针的5’末端；

所述单链核酸片段A的3’末端有羟基，所述单链核酸片段B的5’末端有磷酸基团；所述待测核酸片段包括自上游至下游依次连接的区域片段A’和区域片段B’，即区域片段A’和区域片段B’之间没有核苷酸相间隔。

为减少杂交时的空间位阻，优选地，上述捕获探针还包括连接在单链核酸片段A的5’末端的0-30个T；优选是10个T。

为了将捕获探针牢固地固定到基片上，上述捕获探针的5’末端经氨基修饰；采用其他载体的反应模式时，上述捕获探针的5’末端进行对应的修饰。

在一种实施方式中，上述杂交探针的3’末端连有探针标记物，所述探针标记物优选是荧光素。

在另一种实施方式中，上述试剂盒还包括标记探针，所述标记探针包括带有探针标记物的通用片段C，所述通用片段C的3’末端是所述标记探针的3’末端，所述探针标记物优选是荧光素；

所述杂交探针还包括连接在所述单链核酸片段B的3’末端的通用片段B；

所述通用片段C与所述通用片段B完全反向互补。

上述通用片段B是相对非常保守的序列，与公布的细菌等多数微生物基因组序列杂交几率较小；进一步，通用片段B具体应该是与所述捕获探针以及所述待测核酸片段均不杂交的片段；通用片段B优选是序列表中序列2所示的20个核苷酸组成的片段。

本发明的另一目的在于提供一种核酸检测的方法。

本发明提供的核酸检测的方法，包括如下步骤：

1)将任一上述的试剂盒中的捕获探针制成基因芯片，然后将待测核酸片段与所述基因芯片进行第一次杂交；

2)在步骤1)的基础上，将所述试剂盒中的杂交探针加到所述基因芯片上进行第二次杂交；

3)在步骤2)的基础上，将所述捕获探针的单链核酸片段A的3’末端的羟基与所述杂交探针的单链核酸片段B的5’末端的磷酸基团在连接酶的作用下形成稳定化学键，从而所述捕获探针与所述杂交探针连接，得到探针连接物；

4)在步骤3)的基础上，针对探针连接物上进行检测。

在步骤2)中，所述杂交探针是上述一种实施方式中所述的杂交探针；步骤4)中，所述针对探针连接物进行检测为利用芯片扫描仪针对上述一种实施方式中所述的荧光素进行扫描，得到荧光信号。

在步骤2)中，所述杂交探针是上述另一种实施方式中的杂交探针；步骤4)中，所述针对探针连接物进行检测包括如下步骤：在步骤3)的基础上，往所述基因芯片中加入上述另一种实施方式中所述的标记探针进行显色杂交，然后利用芯片扫描仪针对上述另一种实施方式中所述的荧光素进行扫描，得到荧光信号。

本发明通过设计两条序列位置相邻的捕获探针、杂交探针分别与靶基因进行的两次杂交，在杂交后进行位点特异连接反应，结合强烈洗脱的方法，增强核酸检测的特异性，减少了假阳性结果。本发明能特异检测细菌、病毒、寄生虫等多种物种的核酸(DNA或RNA)，并可用于96孔板、磁珠等进行固相、液相杂交的其他反应模式。

附图说明

图1为直接标记法检测芯片扫描结果。

图2为复杂的标记探针信号放大法检测芯片扫描结果。

图3为简单直接标记法流程示意图。

图4为复杂标记探针信号放大法流程示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、直接标记法检测

操作过程的流程示意图如图3所示。

一、制作探针