[发明专利]一种荧光T载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种荧光T载体以及其的构建方法，还涉及该荧光T载体在基因克隆中的应用。

背景技术

PCR(Polymerase chain reaction)是分子生物学和基因工程研究领域中的常规实验技术，是目前基因克隆，基因或DNA片段研究的必经之路。克隆PCR产物最直接、最方便的方法是T/A克隆。所谓T/A克隆就是将3`端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到3`端具有单个T尾巴的T载体上。在PCR扩增过程中，由于Taq酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性而在PCR产物的3`端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的腺嘌呤脱氧核苷酸(A)，从而便得50％以上的PCR产物的3`末端具有单个腺嘌呤脱氧核苷酸，即3`端A尾巴(Clark JM.Novel non-templated nucleotide additonreactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNApolymerases.Nucleic Acids Res.1988，16(20)：9677-9686；Schutte BC，Ranade K，Pruessner J，Dracopoli N.Optimizedconditions  for cloning PCR products into an XcmI T-vector.BioTechnique.1997，22(1)：40-42；Ichihara Y，Kurosawa Y.Construction of new T vectors for direct cloning of PCR products.Gene.1993，130(1)：153-154.)。

因此，开发出一种3`末端带一突出“T”的特殊载体——T载体，用于克隆Taq酶扩增的PCR产物，以克服传统克隆技术载体容易自连，克隆效率低，筛选阳性克隆难度大，实验费用高等缺点。根据构建策略的不同，T载体制备方法有3种：方法一是利用产生平末端的内切酶将环状质粒酶切成线状质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到线状载体的3`末端(Holton TA，Graham MW.A simple and efficient method for direct cloning of PCR productsusing ddT-tailed vectors.Nucleic Acids Res.1991，19(5)：1156.)。方法二是利用Taq酶的不依赖于模板的末端转移酶活性，在不存在脱氧腺嘌呤核苷酸(dATP)的情况下有相对良好的3`末端加“T”的能力，将单个脱氧胸腺核苷酸(dTTP)添加到线状载体的3`端(Marchuk D，Drumm M，Saulino A，Collins FS.Construction ofT-vectors，a rapid and general system for direct cloning ofunmodified PCR products.Nucleic Acids Res.1991，19(5)：1154.)。方法三是在质粒载体的多克隆位点引入特定的酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3`具有单个T突出的线性T载体。理论上，可以用来制备T载体的内切酶包括：Xcm Ⅰ、Ahd Ⅰ/Eam1105Ⅰ/EclHK Ⅰ/AspEⅠNruG Ⅰ/BspOⅥ、Bfi Ⅰ/Bmr Ⅰ、Hph Ⅰ/AsuHP Ⅰ、Mbo Ⅱ/Ncu Ⅰ、BfuⅠ/BciⅥ、HpyAⅤ/Hin4Ⅱ等。其中Xcm Ⅰ和Ahd Ⅰ及其同裂酶在制备T载体中广泛应用。其它内切酶不是因为太昂贵，就是因为在普通克隆载体上有太多的识别位点，因而在制备T载体的应用中受到限制。

目前常用的T载体大多为商品化的载体，这些T载体基本上可以满足PCR产物克隆的要求，但要进行蛋白表达、纯化以及对蛋白突变体进行筛选还需要寻找更有利的载体。