[发明专利]一种荧光T载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种荧光T载体，其特征在于在出发载体pMD18-T SimpleVector中引入增强子序列和编码红色荧光蛋白UPMT的cobA基因序列，所述cobA基因序列远5`端的SamⅠ酶切位点为酶的保守位点。

2.根据权利要求1所述的荧光T载体，其特征在于所述红色荧光蛋白UPMT为尿卟啉原甲基化酶，其编码基因为cobA。

3.一种荧光T载体的构建方法，其特征在于所述方法包括：

(1)用上游引物1：5`-GAACTGCGGAGGCTCCTGGAC-3`，下游引物2：5`-TTAAGATGACTCAACCCAGAAG-3`，克隆大小807bp的cobA基因，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收；

(2)在出发载体pMD18-T Simple Vector上装入编码去除导肽的红色荧光蛋白UPMT的基因序列(cobA基因)，制备前T载体，命名为pUC18-cobA；

(3)用突变引物1和突变引物2以pUC18-cobA质粒为模板，PCR扩增，纯化产物的5`端磷酸化后连接，转化大肠杆菌DH5α，获得突变体质粒pUC18-EcobA；

(4)用突变引物3和突变引物4以pUC18-EcobA质粒为模板，PCR扩增，DpnI消化过夜，纯化产物转化大肠杆菌DH5α，紫外灯下挑选红色菌斑，摇菌提质粒，经测序获得序列无误的突变体质粒pUC18-EcobA1；

(5)Sam Ⅰ酶切pUC18-EcobA1质粒，纯化产物利用Taq酶，在只添加脱氧胸腺核苷酸(dTTP)的条件下PCR扩增，72℃温育2小时；纯化PCR产物，即获得含有红色荧光蛋白UPMT的成熟T载体，命名为pUC18-EcobA-T。

4.权利要求1或2中所述的荧光T载体在DH5a、JM109、XLBlue-1、TG1菌株中的应用。