[发明专利]一株广谱有机磷农药降解基因工程菌株的构建与应用

说明书

一、技术领域

本发明涉及一株广谱有机磷农药降解基因工程菌的构建及其应用，属于生物工程技术领域。 

二、背景技术

有机磷农药可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使乙酰胆碱(一种神经传导物质)在肌体组织中积累起来，从而引起某些神经功能紊乱等一系列中毒症状，严重者可使神经麻痹，以致死亡。有机磷农药的使用对人体健康或生态环境构成潜在威胁，很多国家将乐果、敌敌畏、对硫磷等有机磷农药确定为环境优先污染物。80年代初期，美国因农药污染地下水引起中毒事故，而开始对农药污染地下水问题进行调查，在某些地区检测出50多种农药残留，其中属于有机磷的农药及最高检出量(μg/L)为二嗪磷：9；乐果：190；马拉硫磷：23；对硫磷：4；甲拌磷：20。美国EPA在PGWDB中统计了1971-1999年间所报道的有关地下水农药监测资料，有机磷农药共监测72种，检出的有17种，均为用量大、使用广泛的品种。国内研究者对此也进行大量的研究，徐炜采用高效液相色谱，直接进水检测5份水样中的8种有机磷农药，检出乐果和甲基对硫磷。康跃惠用C18固相萃取法萃取、GC-FPD测定自来水厂源水中有机磷农药，结果表明：源水可检出敌敌畏、敌百虫、久效磷、乐果、对硫磷、甲基对硫磷。尹明泉研究了德州市农药对地下水污染，检测四个井水的敌敌畏、乐果、马拉硫磷和对硫磷，结果表明有机磷农药对监测区地下水的污染很普遍，最高质量浓度分别为敌敌畏：13μg/L；乐果：22.0μg/L；对硫磷：11.8μg/L；马拉硫磷：6.3μg/L。张秋菊等于2000年5月选择喀什地区产棉大县莎车和英吉沙两县，根据地下水水层分布，选择不同深度的地下水层布20个采样点采集水样，分别测定了水中的敌敌畏、敌百虫、甲拌磷、六六六、滴滴涕、功夫菊酯、久效磷、氧化乐果等农药。检测结果表明，20份水样中检出1种、2种和3种农药的份数分别为5份、6份和3份，总检出率为70％。 

综上所述，有机磷农药污染是一个复杂的多有机磷农药混和污染，降解单一有机磷农药的微生物菌剂已经不能满足生物修复的需求，因此，通过基因工程的手段有目的的将降解不同农药的基因构建于同一株菌中，获得遗传稳定的，符合环境释放条件，同时能降解多种农药的工程菌株。构建基因工程菌的方法主要有基因改造法和质粒转移法两种。质粒的不稳定性会导致外源基因和尤其是抗生素抗性基因的迁移，将外源基因构建于质粒载体而获得的基因工程菌的方法越来越受到限制，因此必须将外源目的基因整合到受体菌的染色体上去。将外源目的基因整合到受体菌染色体上的常用方法主要有同源重组和转座子随机插入。同源重组必须要拥有同源序列才能进行整合，因此，该方法有一定的局限性。应用转座子随机插入通常情况下应用抗生素抗性基因作为正向筛选标记，导致抗性基因的引入，存在环境风险。因此，迫切需要发展能将 外源基因整合到受体菌染色体上且不带入外源抗性基因的整合技术，构建生态安全型的基因工程菌株应用于实践。 

随机插入载体pUT mini-Tn5已经被用来作为插入工具构建工程菌株，但国际上还未见最终不带有外源抗性基因的转座子随机插入载体。反向筛选标记是作为去除抗性基因的常用方法^[16-20]，果聚糖蔗糖酶基因sacB可以将蔗糖转换成大分子的果聚糖并使其在阴性菌的周质空间大量积聚而阻止宿主菌与外界的物质传递与运输，从而致使宿主菌停止生长或死亡，只有那些发生了交换事件将sacB基因和抗生素抗性基因删除的菌株才会在添加了蔗糖的选择性平板上生长而得以被筛选出来，本专利利用反向筛选标记sacB基因以pUT mini-Tn5为基础，构建出了染色体无标记随机整合系列载体，并利用该载体构建出遗传稳定、生态安全的广谱有机磷农药降解工程菌株。 

三、发明内容

技术问题  本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，构建遗传稳定的、符合环境释放条件、同时能降解多种农药的工程菌株，为多种有机磷农药污染的修复提供良好的生物材料。 

技术方案 

一种基因工程菌株，该菌株lgmp为副球菌(Paracoccus sp.)，2010年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.3639。 

有机磷农药降解基因工程菌株lgmp，构建方法如下： 

1)有机磷农药水解酶基因mpd和oph插入到载体pUTTnsTet