[发明专利]一株广谱有机磷农药降解基因工程菌株的构建与应用

权利要求书

1.一种基因工程菌株，该菌株lgmp为副球菌(Paracoccus sp.)，保藏号为CGMCCNO.3639。

2.根据权利要求1所述基因工程菌株，其构建方法为：

1)pUTTnsTet-mpd和pUTTnsTet-oph的构建

取含载体pUTTnsTet的大肠杆菌，划线于含100mg/kg的四环素、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养24h，挑单菌入含相同抗生素的LB液体试管，37℃ 150rpm转摇18h，碱裂解法提取质粒pUTTnsTet，用限制性内切酶ApaI对质粒pUTTnsTet进行单酶切，回收线性片段；采用PCR扩增的方法分别从有机磷农药降解菌Psedudomonasputida DLL-1和Arthrobacter sp.scl-2中扩增出mpd基因和oph基因，引物两端引入ApaI酶切位点，通过酶切酶连连入pUTTnsTet，分别命名为pUTTnsTet-mpd和pUTTnsTet-oph；

2)三亲结合将有机磷农药水解酶基因mpd插入到受体菌Paracoccus sp.L3染色体中将含载体pUTTnsTet-mpd的供体菌E.coli DH5αλpir、辅助菌E.coli pRK600、受体菌Paracoccus sp.L3分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤1次，浓缩后混合三种菌液于0.22μm微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上30℃培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100mg/kg链霉素、100mg/kg四环素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即获得接合子；

3)蔗糖选择压力反向筛选发生同向重复序列交换剔除外源抗性基因的整合子Paracoccus sp.L3-mpd

将获得的接合子在含质量体积比10％蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接LB培养基添加10％蔗糖、200mg/kg甲基对硫磷的SLB平板和LB培养基添加100mg/kg四环素的TLB平板，挑选能在SLB平板上生长且能产生水解圈，且不能在TLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌株Paracoccus sp.L3-mpd；

4)三亲结合将有机磷农药水解酶基因oph插入受体菌Paracoccus sp.L3-mpd染色体中将含载体pUTTnsTet-oph的供体菌E.coli DH5αλpir、辅助菌E.coli pRK600、受体菌Paracoccus sp.L3-mpd分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤1次，浓缩后混合三种菌液于0.22μm微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上30℃培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100mg/kg链霉素、100mg/kg四环素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即获得接合子；

5)蔗糖选择压力反向筛选发生同向重复序列交换剔除外源抗生素基因的整合子Paracoccus sp.lgmp

将获得的接合子在质量体积比10％蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接SLB平板和TLB平板，挑选能在SLB平板上生长且能产生水解圈，且不能在TLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌株lgmp。

3.权利要求1或2所述的基因工程菌在降解农药方面的应用。