[发明专利]紫色叶脉融合基因及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用

说明书

【技术领域】：本发明属于植物基因工程领域，具体地说是用拟南芥的叶脉特异性VS启动子与番茄花氰苷合成途径的调节基因构建PL2融合基因及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用。

【背景技术】：植物转基因技术是利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因导入植物细胞或组织，并在其中进行表达，从而使植物获得新的性状。转基因作物可提高农作物的产量，提高植物中有益成分的含量，改变植物的颜色，减少除草剂、杀虫剂等农药的使用量等，并节省大量人力，因而给人类社会带来了巨大的经济和社会效益。但同时转基因植物的安全性也在全球范围内引起了激烈的争论与普遍关注，其中由于目前的转基因技术常通过使用抗抗生素类或抗除草剂类选择性筛选标记来进行转基因植物的筛选，这些选择性筛选标记基因最终会与目的基因一同整合到植物的基因组中，成为影响转基因植物安全性的主要因素之一。解决转基因植物中抗性标记基因安全性问题有两个途径：(1)转化时仍使用抗性标记基因，获得转基因植物以后，再将其基因组中的抗性标记基因删除。但这种方法步骤繁琐、获得无标记转基因植株的周期较长；(2)发展安全性标记基因用于植物遗传转化，而利用颜色作为安全性可视筛选标记将是一个很有前景的研究方向。另一方面，各国在世界贸易活动中为保证本国经济利益不被侵害，对转基因植物及产品的检测是必不可少的。同样，在对转基因生物安全管理过程中，是否发生基因漂移等是生态环境安全检测的一个重要方面。目前这些方面的检测多使用转基因成分分析方法，主要有DNA检测法和蛋白质检测法两类(杨建霞，2004)。此外，基因芯片技术已开始应用于转基因植物的检测。而这些方法无疑都需要投入较大的人力物力成本。如果能在转基因植物中引入安全、持久、可视的筛选标记，将可以利用显著可视的性状直接区分转基因和非转基因植物，以及判断是否发生基因漂移等，将可以大大降低转基因生物安全检测的投入和成本。

在整个植物界几乎所有的植物的叶片都表现出绿色，而花和果实则呈现出五颜六色，这和植物的叶片、花、果实中的色素成分以及含量不同有关，叶绿素在叶片中占主导地位，而在花和果实中，花氰苷的含量远远超过叶绿素，从而赋予植物花和果实各种各样的颜色。花氰苷是花青素与各种单糖结合而形成的黄酮多酚类化合物。它是植物合成的一类次生代谢物，能控制植物从红到紫甚至是蓝的一系列变化，主要积累在植物表皮细胞的液泡内。前期研究表明，一些转录调节因子对植物花氰苷的合成具有调控作用。例如：Elomaa等(Elomaa et al.，2003)将大丁草转录调节因子基因GMYB10置于CaMV35S启动子之下转入烟草中，转基因植株径、叶、花萼、花粉囊、子房壁均较对照积累大量花色素苷，颜色发生改变。Quattrocchio等(Quattrocchio et al.，1999)将玉米的C1和Lc基因转入矮牵牛之后，得到红色的愈伤组织和粉红色花冠。这些结果表明花氰苷合成的控制因子可以异源发挥对花氰苷合成的调控作用。

组织或器官特异性启动子能够调控目的基因在特定的组织或器官表达，在植物基因工程技术中，可以利用组织或器官特异性启动子有针对性地、特异、高效地调控目的基因的表达。叶脉位于植物地上部的叶片内，由贯穿在叶肉内的维管组织组成，是叶的输导和支持结构。我们设想：如果获得能够驱动目的基因在叶脉中特异性表达的启动子，在植物基因工程技术中利用此类启动子有针对性地在叶脉中特异性表达导致或促进花氰苷合成的关键基因，则可以将因花氰苷的特异性积累所呈现的叶脉颜色变化特征(如紫色叶脉)，作为植物转基因技术中的一种可视性筛选标记。据此建立的新型植物转化技术体系，不但能够解决传统的筛选标记可能给转基因植物带来的安全性问题，还可以把这种可视的筛选标记应用于转基因植物的环境安全等检测工作中，以是否具有有色叶脉作为转基因和非转基因植物的区分标记，简单易行，将大大降低转基因植物检测的成本，势必在转基因植物新品种的实际应用过程中发挥巨大作用。