[发明专利]紫色叶脉融合基因及其作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用

权利要求书

1.一种紫色叶脉融合基因，简称PL2融合基因，其核酸序列如序列表1所示；该融合基因是利用拟南芥的叶脉特异性启动子简称VS启动子与番茄花氰苷合成途径的调节基因构建而成的。

2.一种紫色叶脉融合基因，其特征在于，是与权利要求1所述核酸序列有85％以上的同源性的核酸分子。

3.一种紫色叶脉融合基因，其特征在于，利用如权利要求1所述方法，将叶脉或维管束特异性启动子与导致或促进紫色产生的功能基因融合所获得的、可使转基因植物产生紫色叶脉的融合基因。

4.根据权利要求1所述的紫色叶脉融合基因，其特征在于，所设计的VS启动子的PCR扩增引物如下，其中上游引物中引入KpnI酶切位点，下游引物中引入Bgl II和Sal I酶切位点：

上游引物：5’-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3’

下游引物：5’-AGATCTGTCGACATTTGCTGTGTCAATTCTCACTTC-3’

其中上、下游引物所引入酶切位点可根据所选择的双元表达载体上的多克隆位点进行更换；本发明所选用双元表达载体为pCAMBIA1301，是目前常用的商品化载体。

5.根据权利要求1所述的紫色叶脉融合基因，其特征在于，所设计的PL2融合基因的结构基因部分的PCR扩增引物如下，其中上游引物中引入SalI酶切位点，下游引物中引入BstEII酶切位点：

上游引物：5’-GTCGACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCAT-3’

下游引物：5’-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’

其中上、下游引物所引入酶切位点可根据所选择的双元表达载体上的多克隆位点进行更换；本发明所选用双元表达载体为pCAMBIA1301，是目前常用的商品化载体。

6.根据权利要求1所述的紫色叶脉融合基因，其特征在于，构建PL2融合基因的具体操作步骤如下：

(1)以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增VS启动子部分，回收扩增产物并进行TA克隆；

(2)用Kpn I/Bgl II双酶切上述(1)步所获得的含有VS启动子的TA克隆质粒和pCAMBIA1301质粒，分别回收启动子片段和载体大片段；

(3)将上述两个片段混合，在连接酶催化下进行连接反应，获得中间构建“VS启动子-GUS”融合基因；

(4)以番茄基因组DNA为模板，用PCR方法扩增PL2融合基因的结构基因部分，回收扩增产物并进行TA克隆；

(5)用Sal I/BstE II双酶切上述(4)步所获得的含有PL2融合基因结构基因的TA克隆质粒和上述(3)步所获得的含有“VS启动子-GUS”融合基因的中间构建质粒，分别回收结构基因片段和大的载体片段；

(6)将上述(5)步回收的两个片段混合，在连接酶催化下进行连接反应，即完成在pCAMBIA1301载体上的拟南芥VS启动子-番茄花氰苷合成途径调节基因，即PL2融合基因的构建。

7.根据权利要求1、2或3所述的紫色叶脉融合基因作为可视筛选标记基因在植物转基因技术中的应用，其特征在于，用带有PL2融合基因的载体转化植物，用紫色叶脉作为可视筛选标记，可获得含有本发明融合基因序列及载体上同时含有的其他目的片段的转基因植物。