[发明专利]能同时降解果酒中苹果酸和柠檬酸菌株的筛选方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种能同时降解果酒中苹果酸及柠檬酸菌株的筛选方法及应用，是一种利用微生物——陆生伊萨酵母降低果酒中苹果酸和柠檬酸含量的方法，属于食品加工领域。

背景技术

果酒的质量主要取决于水果质量，在气候条件不良的年份(低温、高湿)或由于采收过早往往导致水果原料的质量不能充分体现，造成水果成熟度不够、含酸量高。水果中含量较高的酸主要是苹果酸和柠檬酸。苹果酸，学名羟基丁二酸，主要有三种存在形式，即D-苹果酸、DL-苹果酸、L-苹果酸，自然界存在的苹果酸都是L-苹果酸。L-苹果酸主要存在于不成熟的山楂、苹果和葡萄果实的浆汁中。柠檬酸，学名2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸，天然柠檬酸在自然界分布很广，主要存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝、山楂等果实中。柠檬酸含量随着不同的栽培品种和植物的生长情况而有所变化。

游离酸的存在，不仅使果酒具有酸味，而且可以防止果酒被有害微生物污染和发生化学变化，保持果酒品质的稳定。但是有机酸并不是越多越好，适度的酸度给人带来清新、爽口和愉悦的感觉，酸度过高会使山葡萄酒有酸涩感、酒味粗硬、品质下降。所以在果酒生产过程中往往会面临降酸的问题。

常见的降酸微生物主要包括粟酒裂殖酵母(Schisosaccharomyces pombe)和苹果酸-乳酸菌。粟酒裂殖酵母在厌气条件下分解苹果酸生成乙醇和CO₂。该酵母有较强的耐SO₂的性能，但繁殖与发酵速度较慢，发酵最适温度偏高，并且使用粟酒裂殖酵母纯种发酵得到的果酒品质有股霉味，酒质不佳。苹果酸-乳酸发酵细菌是利用乳酸菌的代谢作用，将酸味尖锐的苹果酸转化成口感柔和的乳酸，从而降低酒的酸度。这种方法可以提高果酒对微生物的稳定性，改变酒中微量组分的含量和比例，改变呈香物质的浓度，有利于提高酒的风味。但这种方法在生产实际应用中也面临着许多困难，例如操作不易控制，并且乳酸菌易引起果酒的多种病害。本发明利用筛选得到的陆生伊萨酵母来降低苹果酸和柠檬酸的酸度，目前尚未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种能同时降解果酒中苹果酸及柠檬酸菌株的筛选方法；通过以苹果酸为唯一碳源做培养基从葡萄园的土壤中筛选得到一株能降解苹果酸和柠檬酸的微生物——陆生伊萨酵母。

本发明的另一目的在于提供一种菌株——陆生伊萨酵母在降解果酒中苹果酸及柠檬酸的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：能同时降解果酒中苹果酸及柠檬酸菌株，其特征在于：以苹果酸为唯一碳源做培养基从葡萄园的土壤中筛选降酸菌，具体筛选方法如下：

采集葡萄园土壤2g加到盛有100mL无菌生理盐水的三角瓶中，并加入8～12粒无菌玻璃珠，充分振荡后静置，取上清液再分别加入到以浓度为2g/L的苹果酸为唯一碳源的液体富集培养基中进行富集培养，培养条件为28℃，150r/min，摇床振荡培养，以24h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，同时苹果酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L；选出生长较好的菌株，将筛选得到的降酸菌用平板划线法进行多次分离纯化后，挑取单菌落接入到YPD斜面培养基上于28℃培养24h后4℃保存。

陆生伊萨酵母在降解果酒中苹果酸及柠檬酸的应用的实验例如下：

将果实原料进行破碎后加入0.05％的果胶酶和100mg/L的SO₂，浸汁12小时后用汁渣分离机进行分离压榨出汁，在30℃条件下接入降酸有效菌进行降酸发酵，发酵48h后进行酒精发酵，酒精发酵是在20～25℃条件下接入酿酒酵母菌，酒精发酵结束后再进行过滤、澄清，最后进入陈酿工序。

酸度检测方法：采用NaOH滴定法(以苹果酸或柠檬酸计)。

菌种鉴定：通过对筛选出的高效降酸菌进行形态学、生理生化特性和分子生物学鉴定。最终确定筛选得到一株具有高效降解苹果酸和柠檬酸能力的菌株(命名为S8)属于伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)种。

菌株的生长特性研究：以培养时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，确定菌体生长曲线。对培养温度、培养基的起始pH值及摇床转速设计不同水平的数值进行试验，最终确定菌株的最适培养温度，培养基的最适起始pH值及最适摇床转速。

菌株的耐受性研究：对SO₂浓度、酒精度及pH值设计不同水平的数值进行试验，最终确定了菌株对SO₂浓度、酒精度及pH值的耐受性。