[发明专利]藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物克隆技术——手导式克隆技术(Handmade cloning)的细胞融合技术环节，尤其涉及藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法。

背景技术

动物克隆的研究对生物医药、治疗性克隆的探索、模式生物的建立以及畜牧业生产等具有重要的意义，可实现动物克隆的技术手段包括传统的依赖于显微操作系统的核移植技术和2004年最新发明的手导式克隆技术。相对于显微操作系统，手导式克隆技术的优点在于其仅用一个刀片就能完成卵母细胞的去核，且去核效率高，整个克隆程序耗时少，成为一种可能代替显微操作技术的新方法。该方法主要技术环节包括：供体细胞培养、卵母细胞体外成熟、卵母细胞去核、细胞融合、种间克隆胚的激活与体外培养。其中细胞融合技术为手导式克隆技术的难点，通常手导式克隆技术中细胞融合时的技术要求特别高，耗时长，电场对融合细胞的作用时间长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高融合效率的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，包括以下步骤：

(1)供体细胞和受体细胞的选择：供体细胞选择藏羚羊成纤维细胞，并将其培养在24孔板中；受体卵母细胞选择山羊、牦牛、黄牛或奶牛卵母细胞中的任意一种；

(2)制作体积为25μL的融合微滴；

(3)供体细胞与受体卵母细胞的融合：依次将受体卵母细胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴内进行操作，形成两个卵母细胞夹杂一个供体细胞的复合体；将复合体移至融合液内平衡2～3min后，再至融合槽内进行电融合即可。

所述步骤(3)中的T20是由占总溶液体积的20％的胎牛血清(FBS)和80％的含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7.2～7.4的溶液；其中双抗是指75μg/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。

所述步骤(3)中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基础培养液中所得的溶液。

所述步骤(3)中的T2B是指在TCM199基础培养液中加入总溶液体积的2％的胎牛血清(FBS)和8mg/mL牛血清白蛋白(BSA)所得的溶液。

所述步骤(3)中的融合液是指先用20mL蒸馏水溶解0.025g MgSO₄，过滤保存；再用20mL蒸馏水溶解0.0147g CaCl₂·2H₂O，过滤保存；将10.93g甘露醇和0.2g聚乙烯醇(PVA)充分溶解于196mL蒸馏水中，然后向其分别加入2mL预先配制好的MgSO₄和CaCl₂·2H₂O溶液，过滤后即得。

所述步骤(3)中的电融合的条件是交流电场7V，脉冲电场70V，持续时间20μs，持续两次，每次间隔0.1s。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、由于本发明以化学试剂——植物血凝素为辅助试剂，因此，改进了以往手导式克隆技术中低效率的细胞融合方式，使得藏羚羊成纤维细胞与山羊、牦牛、黄牛和奶牛卵母细胞在植物血凝素的辅助下高效融合，其融合率分别达到98.25％、99.00％、97.71％和93.17％，从而提高了克隆动物的整体效率。

2、由于本发明采用融合前先用植物血凝素处理使两个卵母细胞和一个体细胞粘附形成三元复合体，然后再进行融合，因此，有效地降低了操作难度，缩减了操作时间。

3、由于本发明采用上覆石蜡油的微滴进行操作，因此，防止了蒸发和潜在的污染，提高了体外操作溶液的稳定性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明中用两个去核卵母细胞和一个藏羚羊成纤维细胞在植物血凝素的辅助下在电场的作用下正在进行融合。

图2为采用本发明方法融合的两个去核卵母细胞与一个藏羚羊成纤维细胞，经过细胞核荧光染色证实已经完全融合。

具体实施方式

一种藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，包括以下步骤：

(1)供体细胞和受体细胞的选择：

供体细胞选择藏羚羊成纤维细胞，并将其培养在24孔板中；核移植时选择培养孔内底部全部长满的细胞作为供体细胞。每次消化1孔细胞，然后将少量细胞移入到T2B的微滴中。

受体卵母细胞选择山羊、牦牛、黄牛或奶牛卵母细胞中的任意一种。