[发明专利]藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法

权利要求书

1.一种藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，包括以下步骤：

(1)供体细胞和受体细胞的选择：供体细胞选择藏羚羊成纤维细胞，并将其培养在24孔板中；受体卵母细胞选择山羊、牦牛、黄牛或奶牛卵母细胞中的任意一种；

(2)制作体积为25μL的融合微滴；

(3)供体细胞与受体卵母细胞的融合：依次将受体卵母细胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴内进行操作，形成两个卵母细胞夹杂一个供体细胞的复合体；将复合体移至融合液内平衡2～3min后，再至融合槽内进行电融合即可。

2.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特征在于：所述步骤(3)中的T20是由占总溶液体积的20％的胎牛血清和80％的含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7.2～7.4的溶液；其中双抗是指75μg/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。

3.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特征在于：所述步骤(3)中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基础培养液中所得的溶液。

4.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特征在于：所述步骤(3)中的T2B是指在TCM199基础培养液中加入总溶液体积的2％的胎牛血清和8mg/mL牛血清白蛋白所得的溶液。

5.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特征在于：所述步骤(3)中的融合液是指先用20mL蒸馏水溶解0.025g MgSO₄，过滤保存；再用20mL蒸馏水溶解0.0147g CaCl₂·2H₂O，过滤保存；将10.93g甘露醇和0.2g聚乙烯醇充分溶解于196mL蒸馏水中，然后向其分别加入2mL预先配制好的MgSO₄和CaCl₂·2H₂O溶液，过滤后即得。

6.如权利要求1所述的藏羚羊成纤维细胞与受体卵母细胞的化学辅助融合方法，其特征在于：所述步骤(3)中的电融合的条件是交流电场7V，脉冲电场70V，持续时间20μs，持续两次，每次间隔0.1s。