[发明专利]APC基因及其单核苷酸多态性的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA测序技术，尤其是一种检测APC基因和其它基因的单核苷酸多态性的技术。

背景技术

目前在西方国家和中国，结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤。腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli，以下简称APC)基因突变首次在家族性腺瘤息肉症(familial adenomatous polyposis，FAP)基因座位上发现，并认为该基因与结直肠肿瘤的发生相关。APC是肿瘤抑制基因(见美国专利RE36,713)。基因组和表观遗传共同作用引起APC基因功能丧失，这在结直肠肿瘤的发生过程中发挥着非常重要的作用。APC基因有多个结构域，可以结合不同蛋白，包括β-连环素、轴蛋白、CtBP、Asefs、IQGAP1、EB1和微管。美国专利5,998,600号披露了APC肿瘤抑制蛋白与β-连环素结合对APC肿瘤的抑制效果起着非常重要的作用，APC或β-连环素突变可破坏上述调节机制。通过形成由轴蛋白、GSK-3b和酪蛋白激酶组成的降解复合物，APC可调节WNT/β-连环素信号传导通路。许多不同类型的突变可引起上述关键功能域的功能丢失。美国专利6,013,461号披露了无义突变可能与结直肠癌有关，有许多例子包括突变影响结合结构域中关键氨基酸，在无主要结构域处形成截短蛋白，干扰编码主要结构域的外显子剪切等。另外，APC在其他许多基本细胞活动中也都发挥着重要作用，包括细胞黏附和迁移、形成肌动蛋白和微管网络、纺锤体形成及染色体分离。APC突变所引起的上述细胞活动的失调提示其可能与结直肠癌的发生相关。Wood及同事已经对来自许多结直肠患者的基因转录物进行了测序并且发现APC基因在结直肠癌中是一种最常见的突变基因(L.D.Wood等，Science，2007，318，1108-1113)，但他们的结果均来自于对常规PCR扩增基因的外显子序列测定。

单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，以下简称SNP)由Steve Ligget博士首先提出，是DNA序列变异的一种表现，即在同一种族的不同个体(或同一个体的两条染色体)在基因组(或其它序列)中存在单个核苷酸-A，T，C或G的差异。举例来说，来自不同个体的两个DNA片段测定序列AAGCCTA和AAGCTTA中包含有单个不同核苷酸，那么我们就称之为有两个等位基因：C与T。所有常见的单核苷酸多态性序列几乎都只含有两个等位基因。见http://en.wikipedia.org/wiki/Single-nucleotide_polymorphism或其他关于SNP的广泛报道.

在人群中，单核苷酸多态性序列被认为是一种次等位基因率。在某一特定人群中也观察到了转座子的等位基因频率是最低的。两个等位基因频率相对于单核苷酸多态性来说是简单而且小的，但在人群中出现时则会有很多变异，因此一片地理分布或种族人群中出现的SNP等位基因极少与另一片地理分布或种族人群中的相同。随着新一代测序技术的发展，人们已经对肿瘤基因组序列测定及再测定，其中有两个主要研究方向：其一是许多技术主要通检测全基因组外显子的扩增产物的突变，之后再进行序列测定，最近已完成了许多肿瘤全基因组外显子序列测定，包括乳腺癌、结直肠癌(L.D.Wood等，Science，2007，318，1108-1113)、胰腺癌(S.Jones等，Science，2008，321，1801-1806)和恶性胶质瘤(D.W.Parsons等，Science，2008，321，1807-1812)；另一个方法是肿瘤基因全基因组序列测定。第一个被报道的例子的是由Ley等和Mardis等所做的研究，他们采用Illumina测序技术对一个原发、细胞遗传学正常的急性粒细胞白血病未分化型(AML-M1)患者新的基因组及与其相匹配的正常皮肤基因组进行测序，检测到了基因编码序列的12种继发(体细胞)突变与基因组中保守的或调节部位的52个体细胞点突变(T.J.Ley等，Nature，2008，456，66-72；and E.R.Mardis E.R.等，N.Engl.J.Med.，2009，361，1058-1066.)。之后，Shah等人以Illumina测序技术为基础，对原发肿瘤患者当时及该患者9年后转移病灶进行基因组测序后发现，在转移灶中有32个体细胞突变，而在原发肿瘤部位仅检测到了11个(S.P.Shah等，Nature，2009，461，809-813；M.J.Clark等，PLoS Genet.，6，2010，e1000832)。

发明内容