[发明专利]一株绿青色拟青霉及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株绿青色拟青霉及其应用。

背景技术

苹果酸(Malic acid)化学名称为2-羟基-γ-二酸。成品为白色结晶体或结晶状粉末，有较强的吸湿性和特殊愉快的酸味。苹果酸是一种重要的天然有机酸，广泛存在于水果与蔬菜中，是继柠檬酸、乳酸之后的世界第三大酸味添加剂。它在食品工业、临床医药、化学工业和饲料工业等领域中的应用很活跃且十分重要。苹果酸是一种低热量的理想食品添加剂，具有口感柔和，风味独特的特点，可用于食品的酸味剂和保鲜剂。与柠檬酸相比产生热量更低，口味更好，且不损伤口腔和牙齿。美国和欧洲软饮料使用的酸味剂中，已减少柠檬酸用量，增加苹果酸的用量，并有逐渐替代柠檬酸的势头，是目前世界食品工业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。

苹果酸的生产方法主要有发酵法和转化法。化学合成法生产的苹果酸在应用上受到限制。转化法主要是固定化酶和固定化细胞转化，即以富马酸为底物转化成苹果酸。20世纪80年代末以来，无论是对固定化酶还是固定化细胞转化的工艺都获得突破，并成功应用于工业化生产。专利号CN91103606.7的专利公开了一种用固定化细胞以富马酸为原料生产L-苹果酸的方法。将发酵得到的微生物细胞用多孔珍珠岩粉吸附，再用聚乙烯醇包埋，低温固化。固定化细胞的延胡索酸酶回收率90％以上，产物对底物的转化率80％以上。专利号为CN92107642.8的专利中公开了一种用酶工程技术制备苹果酸的方法。将富马酸钠通过酶促转化、转晶、酸化、浓缩、干燥等方法，得到一种质量稳定，纯度高，与天然苹果酸特性相同的苹果酸，用于食品、工业、医药化工等领域。

然而高纯度化学合成的的富马酸价格较高，生产污染大，产品中杂酸偏高。相比之下糖质原料发酵法具有原料来源丰富、产品成本低廉、杂酸质量分数低、食用安全性高等优点，微生物发酵法生产L-苹果酸受到国内外越来越多的关注。

1991年Battat等，以16L搅拌罐发酵，黄曲霉(Aspergillus)在为发酵菌种，搅拌转速350r/min、添加Fe²⁺12mg/L、氮271mg/L、磷酸盐1.5mol/L和9％的碳酸钙条件下，发酵192h，利用120g/L葡萄糖产113g/L苹果酸(Battat E，Peleg Y，BercovitzA et al.Optimization of L-malic acid production Aspergiullsflavus in a stirred fermentor[J].Biotechnology and Bioengineering，1991，27：1108～1116)。国内1994年，金其荣等分离得到利用糖质或淀粉的黄曲霉菌株AspergillusUVT3，经诱变及优化工艺条件后，在500L发酵罐中以大米为原料，通风发酵140h，连续5批的产酸量为44g/L-49.5g/L(金其荣，许赣荣，吴燕萍.直接发酵法与酶转化法生产L-苹果酸的比较[J].食品科学，1994，169(1)：25～28)。专利号为CN94105633.3的专利中公开了L-苹果酸高产突变株曲霉(Aspergillus)N1-14′及利用该菌株生产L-苹果酸的方法，该发明提供的曲霉N1-14′CCTCCM94103能够直接发酵糖质原料产生L-苹果酸，该产酸菌株在20m³罐上，发酵糖质原料100-120h，产酸75-85g/L，产酸速率0.65-0.71g/(1.h)，对糖转化率65％-68％。

目前国内外利用发酵法生产苹果酸多采用黄曲霉为发酵菌种，然而某些黄曲霉的代谢产物黄曲霉毒素毒性大致癌性强，发酵产物存在安全问题。申请号为200810018924的专利中公开了一种利用米根霉发酵产L-苹果酸的工艺，包括米根霉孢子悬浮液的制备、种子培养以及发酵生产L-苹果酸，并在发酵过程中向发酵培养基中添加Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cr⁶⁺中的一种或几种，以改变米根霉的传统代谢途径，使其发酵主要产物为L-苹果酸。该方法可以使产物L-苹果酸从安全菌种米根霉发酵的副产物变成主产物，避免了使用致癌菌种黄曲霉发酵生产L-苹果酸的不安全性。