[发明专利]用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物。

背景技术

弓形虫(Toxoplasma gondii.)是一种人类和动物体内的专性细胞内寄生原虫。呈世界性分布，宿主范围十分广泛，细胞内专性寄生，能侵染包括人类在内的所有温血脊椎动物。猫是弓形虫的终末宿主，猫感染弓形虫后主要通过粪便感染其他宿主。在哺乳动物中，小鼠和猪对弓形虫尤为敏感，常能表现出明显的临床症状，在感染后产生大量的速殖子在血液中穿行。而其他动物被弓形虫感染后通常没有明显的临床表现，弓形虫在体内形成包囊寄生在宿主体内。弓形虫属机会致病原虫(opportunistic protozoan)，在人群中的感染比例相当高，全世界约有1/3的人检测抗体成阳性，人感染弓形虫后通常不发病，但是在在免疫抑制及免疫缺陷人群，如器官移植、恶性肿瘤及艾滋病患者中，弓形虫会引发严重的临床并发症，是重要的致死病因之一；孕妇在怀孕期间感染弓形虫会传染给胎儿，引发先天性弓形虫病，可导致死胎、胎儿或婴幼儿发育畸形、智力障碍、脑炎、脑膜炎等，严重者会导致死亡。

弓形虫的现有检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养法，需要一定数量的实验动物，而且实验周期较长。血清学诊断方法包括美蓝染色试验、间接荧光抗体试验(IFAT)、凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。分子生物学诊断方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)和荧光核酸探针分子杂交。分子生物学诊断方法比前两种方法快速、灵敏，但需要使用专门的仪器，如PCR仪，而荧光探针的制备比较昂贵，不适于基层应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测弓形虫的环介导等温扩增(Loop-mediaed isothermal amplificaion，LAMP)反应引物。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物，其是根据弓形虫RH株的保守基因，AF146527基因设计的两套引物，AF146527基因序列如Seq ID No.1所示。两套引物包括与弓形虫AF146527重复区基因结合的内侧引物对和与弓形虫AF146527重复区基因结合的外侧引物对，其中所述内侧引物对包括内侧上游引物FIP1：5′-CCGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTCGGAGAGGGAGAAGATGTT-3′，内侧下游引物BIP1：5′-CCTCGTGGTGATGGCGGAGATCCCTTCGTCCAAGCCTC-3′；以及内侧上游引物FIP2：5′-CGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTTTTTCGGAGAGGGAGAAGATGTTT-3′，内侧下游引物BIP2：5′-CTCGTGGTGATGGCGGAGATTTTCGTCCAAGCCTCCGACTCTG-3′；所述外侧引物对包括外侧上游引物F3：5′-GTTGGGAAGCGACGAGAG-3′，外侧下游引物：B3：5′-ACAGTGCATCTGGATTCCTC-3′；以及外侧上游引物F3′：5′-GTTGGGAAGCGACGAGAG-3′，外侧下游引物：B3′：5′-CAGTGCATCTGGATTCCT-3′。其中，第一套引物组包括FIP1、BIP1、F3、B3，第二套引物组包括FIP2、BIP2、F3′、B3′。

本发明还提供上述引物在检测弓形虫中的应用，具体方法为：1)提取弓形虫DNA；2)利用上述的内侧引物对和外侧引物对进行环介导等温扩增反应；3)结果检测。

所述环介导等温扩增反应体系如下：

反应的条件为：60-65℃，20-90分钟。

所述结果检测的方法包括琼脂糖凝胶电泳法、显色法等。

本发明进一步提供含上述用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物的试剂盒，其包括：两套引物组、Bst DNA聚合酶、反应混合液(包括：10x Thermopol缓冲液、甜菜碱)、弓形虫DNA阳性对照、双蒸水(ddH₂O)。

本发明的优点在于：

(1)采用本发明提供的引物进行弓形虫检测，特异性和灵敏度高，可检测出100fg的弓形虫DNA。

(2)与PCR检测方法相比，应用本发明提供的用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅即可。

(3)检测结果使用荧光染料即可判定，操作简单方便。