[发明专利]用于检测弓形虫的引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测弓形虫的引物、试剂盒及方法。

背景技术

弓形虫病是由弓形虫寄生引起的一种感染，世界各地的弓形虫感染非常普遍，美、英的成年人中，大约16-40%曾经感染，有的调查达70%，而欧洲大陆和拉丁美洲的成年人，50-80%有过感染，法国人高达90%。我国弓形虫感染低于国外。弓形虫可经孕妇胎盘侵入胎儿，并可对之造成严重损害，如脑积水、小脑畸形、失明及智力发育障碍等。因此，快速可靠的产前诊断是十分需要的。如果怀孕头3个月发生先天性感染，大约40%胎儿可能有严重损害，出现流产、死胎或新生儿疾病，或者出生后有眼、脑或肝脏的病变或畸形，如视网膜脉络膜炎、白内障、脑内钙化、脑积水、小头畸形、智力障碍、黄疸和肝脾肿大。怀孕末3个月发生的感染，严重者不到3%。因此孕前检查并治疗是非常必要的，孕间的检测也不容忽视。

目前已有的弓形虫检测方法有以下几种：

1）直接镜检  取患者血液、骨髓或脑脊液、胸腹水、痰液、支气管肺泡灌洗液、眼房水、羊水阴道分泌物等作涂片，或淋巴结、肌肉、肝、胎盘等活组织切片，作瑞氏或姬氏染色镜检可找到滋养体或包囊，但检出阳性率不高，不够灵敏可信。

2）动物接种或组织培养  取待检体液或组织悬液，接种小白鼠腹腔内，可产生感染并找到病原体，第一代接种阴性时，应盲目传代3次；或作组织（猴肾或猪肾细胞）培养以分离、鉴定弓形虫。但此方法时间长，检出率低。

3）免疫学检查  检测抗体所用抗原主要有速殖子可溶性抗原（胞质抗原）和胞膜抗原。前者的抗体出现较早（用染色试验、间接免疫荧光试验检测）、而后者的抗体出现较晚（用间接血凝试验等检测）。同时采用多种方法检测可起互补作用而提高检出率。但由于弓形虫在人体细胞内可长期存在，故检测抗体一般难以区别现症感染或以往感染。

4）DNA检测技术 国内已建立多聚酶链反应诊断本病毒，并与探针杂交、动物接种和免疫学检查方法相比较，显示具高度特异、敏感和快速等优点。

PCR检测具有高度的特异性和敏感性，可以检测出微量的虫体DNA，从而推断出虫体存在与否，不失为一种较有效的判断母体有无虫血症的病原学诊断手段。国外近年来应用PCR诊断免疫缺陷病人弓形虫感染取得较好的结果。但传统的PCR诊断需要用电泳检测，如申请号为CN200710032159.1的中国发明申请，电泳检测灵敏度一般且不适用于临床，容易因样品污染而增加假阳性结果导致检测结果不准确。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测弓形虫的引物，利用该引物可以在基因水平上对弓形虫迅速的进行诊断。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述的引物制备的用于检测弓形虫的试剂盒，该试剂盒在弓形虫的检测中具有较高的灵敏度和高效、高特异性，检测耗时少、检测结果稳定。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测弓形虫的方法，该方法利用本发明提供的试剂盒进行弓形虫的检测，检测耗时少、检测结果稳定。

本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：

一种用于检测弓形虫的引物，其特征在于该引物为弓形虫特异性B基因，该引物的上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列（5′-TCACAGGCAAGCTCGCCTGTGCTT-3′）；下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列（5′- TTTCCACCCTCCAGGAAAAGCA -3′）。所述的引物可特异性的扩增出弓形虫B基因，该引物用于检测弓形虫时，最好是以人DNA保守序列特有基因β球蛋白（β-globin）基因作为内参引物，该内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3（5′- TGACAAGGCCATGAGGCTGGTGTA -3′），下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.4（5′- GAGTCCATCACGATGCCAGTGGTA -3′）。经实验表明，通过PCR反应，该内参引物较之其它根据人DNA保守序列设计的引物能够更快速有效地识别人体DNA，可以确定模板的提取质量，避免扩增结果的假阴性。

一种用于检测弓形虫的试剂盒，包括PCR反应液、所述的引物和内参引物混合液、阴性对照物、阳性对照物和灭菌双蒸水。该试剂盒采用本发明提供的引物，是一种具有较好灵敏度和高效、高特异性的检测弓形虫的工具。

作为优选方案，所述的内参引物的上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。