[发明专利]lspD抑制剂筛选模型及IspD抑制剂杜米芬的新用途

说明书

技术领域

本发明涉及化学药物和药物筛选领域，具体地，本发明涉及一种结核杆菌酶IspD抑制剂的筛选模型，以及IspD抑制剂杜米芬用于制备抗结核治疗药物的用途。 

背景技术

结核病(Tuberculosis，以下简称为“TB”)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性传染性疾病，严重危害着人类生命健康。现在全球三分之一的人口已经感染了结核分枝杆菌，并且每年新增结核病病例927万例，死亡300万，成为与AIDS、疟疾并称的三大传染病。我国是全球22个结核高负担国家之一，有5.5亿人口感染了TB，患者人数高达550万，居世界第二位，每天新增结核病患者4000多例。 

结核分枝杆菌，属于分枝杆菌属，为结核病的病原菌。结核分枝杆菌的耐药已成为当前结核病治疗中所面临的最严重的问题之一，单药耐药、多药耐药甚至严重耐药(极端耐药)的结核分枝杆菌不断出现和传播，使传统的抗TB药物失去了原有的疗效。在过去的三、四十年中，未能开发出真正有效的新型抗TB药物。而且卡介苗的保护率在发达国家也已经低于50％，在中国则更低。为了应对结核病威胁，迫切需要研制新的抗TB药物。 

一直以来，细胞壁是筛选抗细菌药物的首选靶点。结核杆菌的细胞壁对于其生长繁殖至关重要，在细胞壁各成分的合成与组装过程中有众多的酶系参与，潜在着多个抗结核药物的新靶点。而且其中多数的酶是人体内所不存在的，因此靶向细胞壁的药物具有较好的选择毒性。 

近几年的研究结果表明：在某些细菌、原虫和植物体内存在一条2- 甲基-赤藓糖醇磷酸(methylerythritol phosphate，MEP)途径用于合成类异戊二烯的前体物质异戊酰焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)或二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)。该途径完全不同于哺乳动物和植物胞浆中的甲羟戊酸(MVA)途径。MEP途径合成的类异戊二烯及其衍生物在生物代谢和细胞壁合成中至关重要，因此MEP途径已成为药靶研究的热点。将大肠埃希菌或肠沙门菌MEP途径的某一基因突变或缺失，可引起致死性突变，证实MEP途径对细菌的生存是必需的。由于MEP途径在病原体广泛存在，而不存在于人、动物和植物胞浆中，使得催化该途径的酶成为潜在的、同时又具有选择性的分子靶位。 

MEP途径共包含8个酶参与其中，分别为DXS，IspC，IspD，IspE，IspF，IspG，IspH，Idi。其中ispD(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphateCytidyltransferase，2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞嘧啶转移酶)为这一途径中的关键基因，负责将MEP和CTP(三磷酸胞苷)催化反应生成CDP-ME(如图1所示)。Dean Crick对该基因进行了温度敏感性突变，证明确实该基因突变结核杆菌无法存活(Hyungjin Eoh，Amanda C.Brown，Lori Buetow，et al.Brennan，and Dean C.Crick.Characterization of the Mycobacterium tuberculosis4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-d-Erythritol Synthase：Potential for Drug Development.J Bacteriol.2007，189(24)：8922-8927)。但目前尚没有IspD抑制剂的报道，通过筛选结核杆菌的IspD抑制剂有可能发现全新作用机制的抗结核药物。 

杜米芬(Domiphen Bromide，DMB)系阳离子型表面活性广谱杀菌剂。其适用于口腔、咽喉感染的辅助治疗和皮肤、器械消毒等。目前尚没有杜米芬作为抗结核药物的报道。 

发明内容

为了筛选IspD抑制剂，本发明以IspD为靶标，利用其酶学活性建立IspD抑制剂筛选模型，并评价筛选产物的抗结核活性，最终发现杜 米芬具有抗结核杆菌活性。具体地， 

本发明的一个方面涉及一种筛选IspD抑制剂的组合试剂，其包括MEP、CTP、IspD和待筛选化合物；还包括酶反应缓冲液和离子试剂，其中所述离子试剂包括MgCl₂、NaF及DTT(二硫苏糖醇)；此外还包括测定MEP、CTP和IspD反应所生成的PPi的试剂，所述试剂优选为β-巯基乙醇和钼酸铵。 

其中所述IspD是从能够产生IspD的生物中提取获得或者根据上述生物的基因组序列利用分子生物学方法获得。