[发明专利]一种罗丹明B酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

一种罗丹明B酶联免疫检测方法，涉及一类色素残留检测方法，更具体的说是用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测罗丹明B的残留。属于酶联免疫检测(ELISA)技术领域。

背景技术

罗丹明B(Rhodamine B)为三苯甲烷类碱性染料，具有潜在的致癌和致突变性，我国和欧盟等都不允许在食品中使用。它是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料，在溶液中有强烈的荧光，用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业，不容许用作食品染色。罗丹明B具有脂溶性，会被非法用作调味品(主要是辣椒粉和辣椒油)染色剂。使用了被污染的调味品制作食品时会造成残留。调味品使用罗丹明B染色时含量较高，甚至直接掺入，可进行现场检测。食品中因其含量较低，需送实验室检测。

罗丹明B残留分析方法，主要包括高效液相法(HPLC)，尽管这些方法灵敏度较高，但样品的前处理步骤较多，相对费时且检测费用较高，特别是不适用于大量样品的筛选。

酶联免疫吸附测定法(ELISA)提供了一种痕量罗丹明B的快速、灵敏、选择性检测方法。

发明内容

本发明的目的建立了罗丹明B残留ELISA检测方法，为罗丹明B残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测限(IC90)为0.028ng/mL、半数抑制量(IC50)为1.3ng/mL和检测范围(IC20～IC80)为0.07～17.5ng/mL。

本发明的技术方案：一种罗丹明B酶联免疫检测方法，利用胥传来，宋珊珊，林菲(一种罗丹明B人工抗原的合成方法[P].中国专利：CN200910031727.5)合成的罗丹明B免疫原免疫健康白兔得到多克隆抗体，以罗丹明B为标准品，以罗丹明B半抗原与OVA的偶联物作为包被原，建立调味品中的罗丹明B的间接竞争酶联免疫捡测方法。

本发明通过以下步骤实现：

(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释罗丹明B-OVA包被原，稀释质量比为1∶1000～1∶64000，稀释后加入酶标板中，每孔100μL；4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭、洗涤；

(2)将系列浓度梯度的罗丹明B标准品加入酶标板中，每孔50μL；同时加入以抗体稀释液稀释为1∶1000～1∶4000的多克隆抗体，每孔50μL；37℃竞争0.5h后以含吐温的磷酸盐缓冲液PBST洗涤3～5次，加入以抗体稀释液稀释为1∶1000～1∶3000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(GAR-HRP)，每孔100μL，37℃作用0.5h后以PBST洗涤3～5次；

所述PBST溶液：含0.05％Tween-20的0.01M PBS溶液；

所述封闭液：含0.1％明胶的pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲溶液；

所述抗体稀释液：含0.1％明胶的PBST溶液；

(3)配置显色液

A液：配方为每100mL超纯水中加入0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL 30％H₂O₂；

B液：配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5∶1体积比混合。

(4)加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，酶标仪450nm测吸光值(OD)；根据不同浓度罗丹明B标准液的吸光值绘制罗丹明B浓度-吸光值标准曲线；

(5)调味品的提取液作为样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定，酶标仪450nm测吸光值OD，对照标准曲线测出调味品的罗丹明B浓度。

调味品的提取方法为：

(1)以1-5ng/g水平的罗丹明B加入阴性样品，在室温下至少静置15min；

(2)取辣椒粉1g，加入10mL含20％丙酮的正己烷，振摇10min，静置或过滤使分离出上层清液；残渣加入10mL含20％丙酮的正己烷重复提取一次，合并2次提取液，混匀；

(3)移取提取液于氮吹仪上吹干，用0.01M的PBS重溶；

(4)移取50μL重溶液，作样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定。

更详细的步骤为：

主要溶液配制

1)配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液：

Na₂HPO₄·12H₂O        3.62g