[发明专利]一种罗丹明B酶联免疫检测方法

权利要求书

1.一种罗丹明B酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的罗丹明B免疫原免疫健康白兔得到多克隆抗体，以罗丹明B为标准品，以罗丹明B半抗原与OVA的偶联物作为包被原，建立调味品中的罗丹明B的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下：

(1)以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释罗丹明B-OVA包被原，稀释质量比为1∶1000～1∶64000，稀释后加入酶标板中，每孔100μL；4℃孵育过夜，封闭、洗涤；

(2)将系列浓度梯度的罗丹明B标准品加入酶标板中，每孔50μL；同时加入以抗体稀释液稀释为1∶1000～1∶4000的多克隆抗体，每孔50μL；37℃竞争0.5h后以含吐温的磷酸盐缓冲液PBST洗涤3～5次，加入以抗体稀释液稀释为1∶1000～1∶3000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，每孔100μL，37℃作用0.5h后以PBST洗涤3～5次；

所述PBST溶液：含0.05％Tween-20的0.01M PBS溶液；

所述封闭液：含0.1％明胶的pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲溶液；

所述抗体稀释液：含0.1％明胶的PBST溶液；

(3)配置显色液

A液：配方为每100mL超纯水中加入0.933g柠檬酸，3.68gNa₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂；

B液：配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5∶1体积比混合；

(4)加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，酶标仪450nm测吸光值OD；根据不同浓度罗丹明B标准液的吸光值绘制罗丹明B浓度-吸光值标准曲线；

(5)调味品的提取液作为样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定，酶标仪450nm测吸光值OD，对照标准曲线测出调味品的罗丹明B浓度。

2.根据权利要求1所述的罗丹明B酶联免疫检测方法，其特征在于调味品的提取方法为：

(1)以1-5ng/g水平的罗丹明B加入阴性样品，在室温下至少静置15min；

(2)取辣椒粉1g，加入10mL含20％丙酮的正己烷，振摇10min，静置或过滤使分离出上层清液；残渣加入10mL含20％丙酮的正己烷重复提取一次，合并2次提取液，混匀；

(3)移取提取液于氮吹仪上吹干，用0.01M的PBS重溶；

(4)移取50μL重溶液，作样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定。