[发明专利]一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗病领域，具体涉及一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用。

背景技术

茄子作为中国栽培的主要蔬菜之一，2006年全国播种面积70.27万hm²，总产量2247万t。但是在茄子的生产过程中常由于病害的发生给广大的菜农造成严重经济损失，危害茄子的主要病害有黄萎病、青枯病、绵疫病、褐纹病等，例如茄子青枯病的发生一般会减产20～30％，严重时损失达50～60％，已成为影响茄子高产的主要因素。而且这种病很难根除，采取化学防治为主的综合防治措施也只能收到40～50％的防治效果，用轮作可起到一定的防治作用，但实施比较困难。要防治这些病害的经济，有效的主要对策就是选育抗病茄子品种，既能提高茄子产量，又能减少农药的使用，防止环境污染，而想选育出抗病性强的品种必须有比较理想的育种材料。目前各国开展茄子育种的所用资源遗传基础比较狭窄，是制约茄子抗病育种取得突破性进展的主要因素，野生的茄子材料由于存在生殖隔离的问题，也难以将有利的抗病基因转移到栽培种中。因此要选育优良抗病品种，必须不断地发掘和创新抗病材料，才是解决问题的根本途径。随着植物基因工程的深入研究，分离植物抗病基因已成为现实，将抗病基因导入到受体植物后既可增强植物的抗病性又能保持优良的经济性状，从而为开展植物抗病育种成找到一条新的途径。

目前有关茄子抗青枯病基因工程研究比较落后，大多数主要集中在与抗青枯病性状相连锁的分子标记筛选研究，还没有茄子抗青枯病基因分离的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于根据现有植物育种中存在的遗传基础狭窄、青枯病侵害问题严重且农药的使用会对环境造成污染的问题，提供一种具有抗青枯病功能的基因。

本发明另一目的在于提供上述抗植物青枯病基因的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述抗植物青枯病基因的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种抗植物青枯病基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白如SEQ ID NO：2所示。

本发明抗植物青枯病基因是从半野生茄子E-31中扩增得到的。

本发明抗植物青枯病基因的制备方法是通过cDNA-AFLP差异显示法及RACE法从抗青枯病的半野生茄子E-31中克隆得到的，步骤如下：

(1)对E-31、E-32、F1和F2茄子植株进行人工抗青枯病鉴定，得到抗病植株和感病植株；

(2)分别提取上述抗病植株和感病植株的总RNA，合成cDNA；

(3)利用cDNA-AFLP差异显示法进行筛选，用序列如SEQ ID NO：3～4所述引物扩增出与抗病基因连锁的抗病基因片段，序列如SEQ ID NO：5所示；

(4)利用RACE法扩增抗青枯病基因片段的全长序列：根据步骤(3)所得抗病基因片段设计引物，扩增5’端序列，如SEQ ID NO：6所示；所述引物序列如SEQ ID NO：7～8所示；

(5)根据步骤(3)所得抗病基因片段设计引物，扩增3’端序列，如SEQID NO：9所示；所述引物序列如SEQ ID NO：10～11所示；

(6)根据扩增出的5’端序列和3’端序列进行连接，得到抗青枯病基因的全长序列。

本发明从半野生茄子E-31分离到一个茄子抗青枯病基因，通过转基因把该基因导入到表现优良的感病品种中，可以提高茄子的抗病性，从而可以快速培育出新的茄子抗病品种。具体方法如下：将抗植物青枯病基因序列构建到克隆载体上，利用限制性内切酶进行双酶切，获得目的基因片段，利用内切酶双酶切植物正义表达载体，把酶切获得的基因片段和正义表达载体通过连接酶进行连接，将构建好的植物表达载体转化到农杆菌中，利用农杆菌导入法进行转化，通过筛选，得到具有抗青枯病能力的转基因植株。其中，所述克隆载体优选为pMD19-T；所述限制性内切酶优选为sma I和sac I。

本发明抗青枯病基因还可用于其它抗青枯病资源比较缺乏的植物，如番茄的基因工程育种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从半野生茄子E-31中分离出抗青枯病基因，将该基因倒入到受体植物后既可增强植物的抗病性又能保持优良的经济性状，改良了植物品种；通过本发明将基因导入植物中以提高植物的抗青枯病能力，既能提高植物的产量，还可以减少农药的使用，防止环境污染，适合在农业生产中进行推广。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。