[发明专利]一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法

权利要求书

1.一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体；

2)样品检测；

所述的步骤1)主要包括以下步骤：

a.茶尺蠖核型多角体病毒的分离纯化；

b.将纯化的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原对小鼠进行免疫；

c.细胞融合和克隆：在加强免疫3天后取小鼠脾细胞和正处于对数生长期的骨髓瘤细胞在PEG6000的作用下进行细胞融合，每次融合后，将细胞接种于96孔培养板，用含HAT的1640完全培养基选择培养10天，然后将HAT改为HT培养1周；待细胞长至显微镜视野的1/4，取培养上清用ELISA法检测抗体，以茶尺蠖核型多角体病毒作为包被原对所选阳性细胞进行再筛选，选择最终的阳性细胞以有限稀释法进行克隆；

d.对检测为阳性单克隆细胞株进行传代培养，筛选出阳性单克隆抗体细胞株；

e.杂交瘤细胞腹水效价测定；

f.单抗对病毒蛋白特异性识别；

所述的步骤2)主要包括以下步骤：

a.将待检样品置于包被液中，按每孔100μL加入酶联板的小孔中，设置对照，37℃下包被3-4h或4℃冰箱包被过夜；

b.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

c.加150μL重量百分浓度为2％-5％的脱脂奶粉，37℃下封闭1h；

d.配制茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体于2wt％-5wt％脱脂奶粉中，体积配比为1∶1000，每孔加100μL，37℃下温浴1h；

e.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

f.用1×PBST将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠稀释5000倍，每孔加100μL稀释后的抗体，37℃下温育1h；

g.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

h.加100μL显色液，37℃下温育3-5min；

i.加50μL终止液；

j.用酶标仪测读各孔在λ＝492nm处的光密度值OD，计算P/N＝样品OD值/对照OD值，若P/N≥2.1，即为阳性。

2.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤a所述的茶尺蠖核型多角体病毒分离纯化方法为：以茶尺蠖核型多角体病毒感染茶尺蠖幼虫，收集被感染的茶尺蠖虫尸，用研钵将虫尸磨碎，用5层粗棉布过滤其中较大颗粒后，使用新配制的裂解液裂解1-2h，裂解液为0.1mol/L Na₂CO₃，0.05mol/L NaCl，pH＝10.3；用50％的HCl中和碱液，3000g离心5min，去除其中未裂解的多角体；再160000g、1.5h超速离心，沉淀茶尺蠖核型多角体病毒；最后用PBS溶解纯化的病毒粒子，存于4℃冰箱待用。

3.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤b所述的小鼠免疫具体方法如下：将分离纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒粒子作为抗原与等量福氏完全佐剂充分混合，经皮下多点注射BALB/c小鼠，每只80-100μg，间隔14d用含等量的福氏不完全佐剂的蛋白抗原相同剂量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射不加佐剂的蛋白抗原，每只100μg，3d后取脾细胞用于细胞融合。

4.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤e所述的杂交瘤细胞腹水效价测定方法为：将筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养，并向小鼠腹部注射降植烷，一周后，使用生理盐水将细胞沉淀悬浮，接种于小鼠腹腔，待小鼠腹腔明显鼓胀，抽取腹水测定其抗体效价并保存于4℃备检；培养上清或腹水，经稀释后加到包被原包被的酶标板中，孵育、洗涤后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG，底物显色；阳性对照为小鼠阳性血清，同时分别以同等稀释的Sp2/O培养上清，或无免疫小鼠血清为阴性对照，空白对照为PBS。

5.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤f所述的单抗对病毒蛋白特异性识别方法为：首先是克隆表达茶尺蠖核型多角体病毒蛋白基因，根据茶尺蠖核型多角体病毒基因组的多角体蛋白基因序列，采用DNAStar软件，设计了一对特异性引物如下：EoNPV ph F：5’-atgtatactcgttaca-3’和

EoNPV ph R：5’-ttaatacgcaggtcct-3’，扩增多角体蛋白基因，PCR反应采用25μL体系，PCR扩增程序如下：先94℃预变性3min；然后94℃30s，62℃30s，72℃30s；循环30次，最后72℃延伸10min；PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；

将扩增的基因片段克隆连接至pMD18-T克隆载体，连接产物转化至TG1，提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切切下ph基因片段，并连接到经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的表达载体质粒pGEX-4T2，提取质粒并用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到表达载体质粒pGEX-4T2-ph；

将构建的pGEX-4T2-ph表达载体转化表达菌E.coli BL21，挑取单菌落并在37℃、200rpm/min条件下对其进行培养8-10h；第二天用5％菌液转接于5mLLB液体培养基中，培养2-3h，直至OD600为0.4-0.6，随后加入0.1mmol/L的IPTG，在37℃对其诱导培养6-8h，收集菌体，用PBS稀释，然后加入SDS-PAGE上样缓冲液，进行沸水浴5min，使用12000g转速离心10min去除不溶物质，取10μL样品进行SDS-PAGE检测及Western-blot分析；在此过程中，同时以BL21菌液和转化pGEX-4T2的诱导菌液作为参照；

利用Western-blot对两株单抗的特异性进行鉴定，按常规方法进行；将茶尺蠖病毒粒子、多角体表达蛋白、载体pEGX-4T2表达蛋白进行SDS-PAGE，用小鼠腹水作为一抗。