[发明专利]一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物制剂检测技术领域，具体涉及一种病毒制剂的定性检测方法。

背景技术

茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，EoNPV)属杆状病毒科，核型多角体病毒属，该病毒于1977年在我国首次发现。EoNPV是茶尺蠖的病原性天敌，通过幼虫取食后在虫体内迅速增殖，致使其感染发病而死亡。目前这种病毒已可以通过室内大量增殖，经配制形成产品，进行商业化生产，近年来，EoNPV作为一种高效病毒杀虫剂在各省茶区广泛推广使用，对茶尺蠖进行有效的生物防治，产生了良好的社会、经济和生态效益。因为这种病毒产品不同于一般的农药，它是一个活体，目前只有通过生物测定的方法进行检测。也就是说，用病毒产品喂饲茶尺蠖幼虫，看是否发病来确定该生物农药产品是否有效，这是因为核型多角体病毒是寄主专一性的，因而茶尺蠖病毒只能感染茶尺蠖幼虫。这种传统的生物测定的方法使得目前在EoNPV病毒制剂的生产、使用过程中存在毒力指标检测粗放、评价周期过长、制剂质量难以有效监控等问题。

发明内容

鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明发明利用免疫学原理，通过制备茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体，再借助ELISA手段来定性检测未知样品中是否有茶尺蠖核型多角体病毒。

所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体；

2)样品检测；

所述的步骤1)主要包括以下步骤：

a.茶尺蠖核型多角体病毒的分离纯化；

b.将纯化的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原对小鼠进行免疫；

c.细胞融合和克隆：在加强免疫3天后取小鼠脾细胞和正处于对数生长期的骨髓瘤细胞在PEG6000的作用下进行细胞融合，每次融合后，将细胞接种于96孔培养板，用含HAT的1640完全培养基选择培养10天，然后将HAT改为HT培养1周；待细胞长至显微镜视野的1/4，取培养上清用ELISA法检测抗体，以茶尺蠖核型多角体病毒作为包被原对所选阳性细胞进行再筛选，选择最终的阳性细胞以有限稀释法进行克隆；

d.对检测为阳性单克隆细胞株进行传代培养，筛选出阳性单克隆抗体细胞株；

e.杂交瘤细胞腹水效价测定；

f.单抗对病毒蛋白特异性识别；

所述的步骤2)主要包括以下步骤：

a.将待检样品置于包被液中，按每孔100μL加入酶联板的小孔中，设置对照，37℃下包被3-4h或4℃冰箱包被过夜；

b.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

c.加150μL重量百分浓度为2％-5％的脱脂奶粉，37℃下封闭1h；

d.配制茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体于2wt％-5wt％脱脂奶粉中，体积配比为1∶1000，每孔加100μL，37℃下温浴1h；

e.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

f.用1×PBST将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠稀释5000倍，每孔加100μL稀释后的抗体，37℃下温育1h；

g.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

h.加100μL显色液，37℃下温育3-5min；

i.加50μL终止液；

j.用酶标仪测读各孔在λ＝492nm处的光密度值OD，计算P/N＝样品OD值/对照OD值，若P/N≥2.1，即为阳性。

所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤a所述的茶尺蠖核型多角体病毒分离纯化方法为：以茶尺蠖核型多角体病毒感染茶尺蠖幼虫，收集被感染的茶尺蠖虫尸，用研钵将虫尸磨碎，用5层粗棉布过滤其中较大颗粒后，使用新配制的裂解液裂解1-2h，裂解液为0.1mol/L Na₂CO₃，0.05mol/L NaCl，pH＝10.3；用50％的HCl中和碱液，3000g离心5min，去除其中未裂解的多角体；再160000g、1.5h超速离心，沉淀茶尺蠖核型多角体病毒；最后用PBS溶解纯化的病毒粒子，存于4℃冰箱待用。

所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤b所述的小鼠免疫具体方法如下：将分离纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒粒子作为抗原与等量福氏完全佐剂充分混合，经皮下多点注射BALB/c小鼠，每只80-100μg，间隔14d用含等量的福氏不完全佐剂的蛋白抗原相同剂量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射不加佐剂的蛋白抗原，每只100μg，3d后取脾细胞用于细胞融合。