[发明专利]一种浮游植物群落结构的检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及海洋浮游植物种类和/或数量检测的技术领域，特别涉及一种浮游植物群落结构的检测方法。

背景技术：

浮游生物是一个在水体中营随波逐流生活方式的独特类群，易于在风和水流的作用下做被动运动，没有或仅有微弱的游动能力；浮游生物包括浮游植物和浮游动物两大类。浮游生物个体小，生活周期短，繁殖速度快，对环境的变化十分敏感，对水体的营养状态的变化能够迅速地做出反应。在水质好的水域，浮游生物的多样性指数及均度指数均较大；反之，浮游生物的种类多样性下降，分布呈现不均匀的情况。因此浮游生物群落结构特征的变化可作为指示生态环境变化的重要生物学参数。

赤潮浮游植物，是海水中某些微小的微型藻、原生动物或细菌在一定的环境条件下爆发性增殖或聚集在一起而引起水体变色的一种生态异常现象。在我国海域中，赤潮发生的区域分布很不均匀，浙江沿海及长江口临近海域的赤潮灾害最为严重，此外发生赤潮比较集中的海区还有渤海、福建沿海、珠江口海域等地。1998年春季，珠江口海域发生一次特大面积米氏凯伦藻赤潮，所影响到的海区养殖鱼类几乎全部死亡，造成了珠江口海域三地(深圳、珠海和香港)水产养殖业损失逾4亿元之多；2000年长江口海域发生大面积具齿原甲藻赤潮，危害面积达7000平方千米，2004年5月东海长江口海域发生大规模东海原甲藻赤潮，面积达10000平方千米，世界罕见。近年来，近海海域赤潮更加肆虐，赤潮的爆发越来越频繁，且涉及的范围也越发广泛。赤潮严重破坏了海洋生态平衡，给渔业及旅游业等造成了巨大的损失。除此之外，有些赤潮生物体内或代谢产物中含有生物毒素，通过食物链富集，会严重危害人类的健康。

因此，研究浮游植物赤潮的爆发机制，探索预警、预报乃至防治赤潮的方法已成为一个极具挑战性的课题，其中浮游植物群落结构的检测显得尤为重要。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于，将变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术运用到微藻的鉴定中，并运用该技术对浮游植物多样性进行研究，分析多样性组成与环境因子的关系。

为了实现上述目的，本发明提供了一种浮游植物群落结构的检测方法，其中，包括以下步骤：

a、浮游植物水样采集

b、DNA的提取

c、PCR及琼脂糖电泳检测

d、使用变性梯度凝胶电泳技术进行浮游植物群落结构分析

e、图形处理

f、数据分析。

所述步骤a为：浮游植物水样首先用200目的筛绢过滤，然后将过滤后的海水用0.45μm孔径的硝酸纤维素膜过滤，将滤膜转移至2ml Eppendorf管中，置于-20℃，用于浮游植物群落多样性的分析。

所述步骤b为：

(1)收集和洗涤藻细胞：在收集的藻细胞中中加入750μl TE缓冲液洗涤藻细胞，10000rpm 4℃离心10分钟，小心弃上清；加入250μl TE缓冲液悬浮藻细胞；

(2)裂解藻细胞：加入500μl预热55℃的抽提缓冲液，混和均匀，放入55℃水浴中一小时，直到藻液呈透明状；放进4℃冰箱冷却3分钟；

(3)抽提：加入1ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻柔颠倒，使之呈乳浊液；14000rpm 4℃离心10分钟，小心用微量吸头取出上清液(约600μl)至eppendorf管中，重复抽提一次；

(4)沉淀：加二倍体积的冰冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc，混匀，放入-80℃冰箱30分钟；14000rpm 4℃离心10分钟，小心弃上清；

(5)洗涤：DNA沉淀用预冷的70％酒精洗两次；

(6)溶解：自然风干，溶于20-40μl TE缓冲液中，置于-20℃待用

所述步骤c中PCR进行扩增所使用的引物为：

FP-5’CGCGCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAGGTCTGTGATGCCC3’，RP-5’ACGGGCGGTGTGTRC3’，

所述PCR扩增所用引物或者为：

F 1427-5’CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG3’，

R1616-5’GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG3’，

所述PCR反应体系(50ul)包括：

模板DNA，

200μM dNTP，

1.5mM MgCl2，

0.3μM引物，

2.5U Ex Taq DNA polymerase，