[发明专利]一种浮游植物群落结构的检测方法

权利要求书

1.一种浮游植物群落结构的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、浮游植物水样采集

b、DNA的提取

c、PCR及琼脂糖电泳检测

d、使用变性梯度凝胶电泳技术进行浮游植物群落结构分析

e、图形处理

f、数据分析。

2.根据权利要求1所述浮游植物群落结构的检测方法，其特征在于，所述步骤a为：浮游植物水样首先用200目的筛绢过滤，然后将过滤后的海水用0.45μm孔径的硝酸纤维素膜过滤，将滤膜转移至2ml Eppendorf管中，置于-20℃，用于浮游植物群落多样性的分析。

3.根据权利要求1所述浮游植物群落结构的检测方法，其特征在于，所述步骤b为：

(1)收集和洗涤藻细胞：在收集的藻细胞中中加入750μl TE缓冲液洗涤藻细胞，10000rpm 4℃离心10分钟，小心弃上清；加入250μl TE缓冲液悬浮藻细胞；

(2)裂解藻细胞：加入500μl预热55℃的抽提缓冲液，混和均匀，放入55℃水浴中一小时，直到藻液呈透明状；放进4℃冰箱冷却3分钟；

(3)抽提：加入1ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻柔颠倒，使之呈乳浊液；14000rpm 4℃离心10分钟，小心用微量吸头取出上清液(约600μl)至eppendorf管中，重复抽提一次；

(4)沉淀：加二倍体积的冰冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc，混匀，放入-80℃冰箱30分钟；14000rpm 4℃离心10分钟，小心弃上清；

(5)洗涤：DNA沉淀用预冷的70％酒精洗两次；

(6)溶解：自然风干，溶于20-40μl TE缓冲液中，置于-20℃待用。

4.根据权利要求1所述浮游植物群落结构的检测方法，其特征在于，所述步骤c中PCR进行扩增所使用的引物为：

FP-5’CGCGCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAGGTCTGTGATGCCC3’，RP-5’ACGGGCGGTGTGTRC3’，

所述PCR扩增所用引物或者为：

F1427-5’CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG3’，

R1616-5’GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG3’，

所述PCR反应体系(50ul)包括：

模板DNA，

200μM dNTP，

1.5mM MgCl2，

0.3μM引物，

2.5U Ex Taq DNA polymerase，

1×Ex Taq Buffer；

所述PCR的反应程序为：

94℃，变性2min；

72℃，延伸7min；

PCR反应程序或者为：

94℃，变性5min；

72℃延伸10min。

5.根据权利要求4所述浮游植物群落结构的检测方法，其特征在于，所述步骤c中琼脂糖电泳检测为：将5μl扩增的产物与1ul上样缓冲液混合后上样，1％琼脂糖凝胶电泳，100V恒压电泳30min，在含0.5μg/ml EB的1×TAE缓冲液中染色10～30min，用凝胶成像系统进行拍照。

6.根据权利要求1所述浮游植物群落结构的检测方法，其特征在于，所述步骤d为：采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突变检测系统对PCR反应产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，所述电泳条件为：PCR产物分析采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从35％到50％(100％的变性剂为7M的尿素和40％的去离子甲酰胺的混合物)，150V，1×TAE缓冲液中电泳6h；或者，PCR产物分析采用10％的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从30％到55％，150V，1×TAE缓冲液中电泳8h；电泳完毕后，将凝胶置于0.5μg/ml EB溶液中震荡染色20min，凝胶成像系统拍照。