[发明专利]中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法。

背景技术

中华鲟(Acipenser sinensis Gray)为典型的河海洄游鱼类，国家一级保护动物。目前，利用野生中华鲟亲鱼开展人工繁殖放流已成为该物种保护的重要措施之一，但由于酷渔滥捕、水域污染和水利工程建设等人为活动造成其自然资源不断衰退，中华鲟已处于濒危等级。在野生中华鲟人工繁殖过程中常常遇到雄鱼不足和雄鱼与雌鱼性腺发育不同步的问题，利用超低温冷冻保存技术把中华鲟精子长期有效的保存起来，待遇到成熟的雌性中华鲟亲鱼，即可对精液解冻，并与成熟鱼卵进行人工授精，以解决雌雄亲鱼性腺发育不同步的问题。

国外关于其它鱼类精液超低温冷冻保存研究的报道较多，相关技术也较为成熟，国内也有关于中华鲟精液超低温冷冻保存研究的报道，但有关利用中华鲟超低温冷冻精液人工授精操作方法尚未见报道。

现有技术的缺点：

(1)国内鲟鱼的人工繁殖研究保护工作起步较晚，采用冷冻精液进行人工授精作为人工繁殖的辅助措施，目前仅限于研究探索阶段，尚未应用到生产实践中。

(2)国内外尚未见有关中华鲟冷冻精液人工授精操作方法的报道。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供一种中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法，掌握一种可应用于生产有效的中华鲟冻精人工授精操作方法。

本发明采用以下技术方案：

方案1：中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法，步骤如下：

(1)采集中华鲟雄鱼的精子，进行冷冻保存；

(2)轻压中华鲟腹部能挤出卵或发现中华鲟产卵时开始对冷冻精子解冻；

(3)卵子产出后，立即与解冻精子进行人工授精：冻精授精采用不同激活溶液分步进行激活授精，即将300ml卵子加入5ml解冻精子快速混合，随即加入激活溶液(10-20mM Tris，5-10mM NaCl，0.1-0.25mM KCl，pH 8.5)50ml激活，柔和搅拌20秒后，再次加入解冻精子5ml混合，20秒后加入10-20mM葡萄糖溶液混合搅拌，20秒后加入孵化用水搅拌，然后加入10％滑石粉脱粘，孵化用水冲洗后，将同批受精卵归并同一孵化筛中进行孵化。

上述超低温冷冻精液是在-196℃的超低温保存的优质中华鲟冻精。

本发明具有如下优点：

1、冻精分步激活授精方法有助于提高冻精活力，提高受精率；

2、该方法已在野生中华鲟人工繁殖生产和子代中华鲟全人工繁殖生产中得到良好应用，可有效解决当前中华鲟人工繁过程中雄鱼不足、雌雄亲鱼不能同步成熟的问题，为通过人工增殖方式对中华鲟进行保护，提供有力的技术支撑；

3、本发明中所采用的激活溶液配方能够提高受精率和孵化率；

4、该方法也适用于其他鲟鱼类的冷冻精液人工授精。

具体实施例

本发明的技术方案具体实施例如下。

在中华鲟人工繁殖过程中常常会遇到雄鱼不足的问题，该专利通过利用超低温冷冻保存技术把中华鲟精子进行长期有的效保存，以解决雌雄亲鱼性腺发育不同步及充分利用有限资源，从长远来讲对中华鲟资源的恢复和保护具有十分重要的意义。该实验是通过利用超低温冷冻保存技术保存的子一代中华鲟精子进行了人工繁殖实验和效果分析，旨在完善中华鲟全人工繁殖技术体系，为更好地保护中华鲟种质资源提供技术支撑。

实施对象：

-196℃超低温保存的中华鲟优质冻精。

精卵来源：

用于全人工繁殖的中华鲟精液子与卵子，来自中华鲟研究所在纯淡水条件下驯养的性腺发育成熟的子一代中华鲟雄鱼和雌鱼各一尾，分别于2009年9月29日和2009年11月22日采用促黄体释放激素类似物(LRH-A₂)对成熟的雄鱼和雌鱼进行注射催产，催产水温度为18.8-19℃，采取挤压法采集精子和卵子；精液在保鲜袋中充氧后于2-4℃冰箱内保存，经超低温冷冻投入液氮中保存，人工繁殖实验时冷冻精子再解冻与子一代中华鲟成熟鲟卵进行人工授精。

精子冷冻及解冻：

利用离心管和装有液氮的液氮罐，取活力大于90％的鲜精按体积比1∶3与2-4℃的抗冻稀释液混合，平衡10min，分装1.5ml离心管，采用二步降温法，即距液氮面上2-3cm处平衡10min后，沉入液氮罐底部保存。精液在液氮中保存53天后取出，于38-40℃水浴解冻1min。解冻后的精液于2-4℃的冰箱中保存，待镜检。

冻精活力镜检及激活剂筛选：