[发明专利]重组融合蛋白质在快速诊断检测中的直接应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及直接采用携带融合标签的整体融合蛋白质进行快速诊断检测。

背景技术

检测人类等生物样本中特定蛋白质因子的含量，对于医学、生物学、农牧业等领域的基础研究和实际应用具有非常重要的意义。例如，检测人体血液中针对丙型肝炎等致病病毒特异性抗体的存在，是目前诊断这些传染病的主要手段。同样，测定癌症和心血管疾病的早期生物标记蛋白质因子含量的变化对于这些疾病的早发现早治疗和疗效观察极为重要。随着医学和生物学领域的不断进展，各种蛋白质检测方法应运而生，其中最方便、应用范围最广也是目前使用最多的是各种免疫检测技术，例如免疫沉淀、免疫组织化学、和酶联免疫吸附检测(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，简称ELISA)和快速免疫检测技术等。虽然ELISA比较简便常用，可以定量，但是耗时较长，一般需要4-5小时或者过夜，而且花费较高，需要特定的读测仪器和受过专门训练的工作人员才能完成。而实际工作中往往不具备这些检测条件，或需要立即知道检测结果，因此ELISA的广泛应用受到很大限制。而近年来基于平面流动技术发展起来的快速免疫检测方法，因其操作简单、费用低、耗时短(仅需15-20分钟就可以看到结果)，无论在国内外，在农村还是城市都比ELISA方法具备优势和发展前景。基于此，世界卫生组织(WHO)于2005年提出采用快速检测技术检测禽流感等各类流行性感冒病毒。同时，美国疾病防治中心(CDC)也于2004年建议采用快速检测技术对怀孕妇女和医护工作人员普遍检查人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染情况。

快速免疫检测主要有两类方法。一类方法是检测样本中某一特异性抗原，例如检测人体血液中的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原或表面抗原，这类方法需要亲和力高、信号强、特异性好的相应抗体作为主要检测试剂。另一类方法是检测样本(通常是血液)中针对某一抗原的特异性抗体，例如检测人体血液中针对HIV或者丙型肝炎病毒(HCV)的抗体，这类方法需要纯度高、溶解性好、信号强、特异性专一的相应抗原分子或抗原片段作为主要检测试剂。图1展示针对抗体的快速检测试剂组件。以检测人体血样中HCV抗体为例，在加样处加入血液样品，通过扩散渗透作用经过玻璃纤维到达存放干燥的金标-抗原(本例为HCV核心蛋白)位置，使之溶解。如果血样中存在抗HCV抗体，则这些抗体将与金标抗原结合，形成抗体-金标抗原复合物，继续沿硝酸纤维膜向吸水纸方向移动。到达检测线区域时，与检测线上的固相抗原结合，其中的金标抗原在此处富集而显示阳性反应信号。未结合的金标抗原在质控线区域被此处的固相HCV抗体捕获而显示质量控制信号。如果血样中不含HCV抗体，则金标抗原不能在检测线上富集显色，但是能够在质控线富集显色而呈阴性反应(图1)。

目前国内外针对抗体的快速检测方法和相应试剂普遍存在着检测灵敏度较低的问题，无法有效地检测抗体含量较低的血样，这在我国国内产品中表现尤甚。以HCV抗体快速检测试剂为例，国内一家公司产品对HCV阳性血样的检出率仅为22.5％。造成这一问题的主要原因有：(1)用来作为抗原的蛋白质通常在微生物蛋白质表达系统例如大肠杆菌中产生。由于改变了蛋白质表达的外部环境，许多本来水溶性蛋白质由于形成内含体(inclusion body)等原因，在大肠杆菌中表达后水溶性很差，需要特殊的促溶性处理(比如用高浓度尿素溶解，或者用亚硝基胍使蛋白质变性后再复性)才能用作抗原；而这些促溶性处理除了增加成本、耗费时间、降低产量之外，还不可避免地导致抗原蛋白质产物的不均一性和分子构型及其识别相应抗体特性的改变。(2)实际工作中，用做抗原的蛋白质本身分子量可能很小，而且，为了规避非特异性结合，常常只表达抗原蛋白质的某一段序列(结构域)用作抗原。其分子量就更加小，进行胶体金标记时效果较差，使检测信号微弱，即便有阳性反应，也因为信号过弱而观察不到。

为了克服上述问题，人们提出了一些解决方法，比如通过选择表达抗原蛋白质序列、尝试各种途径促进蛋白质水溶性、改变用于金标的胶体金颗粒大小、提高金标标记效率、采用生物素-链亲和素(biotin-streptavidin)系统放大检测信号等等。这些方法虽然有一定效果，然而，到目前为止，快速免疫检测方法灵敏度低的问题仍然没有得到根本改善。